Prognostické a prediktivní faktory u adenokarcinomu pankreatu

MUDr. Petr Karásek, Ph.D.

Doctoral thesis

Prognostic and predictive factors for pancreatic adenocarcinoma

Abstract:

U duktálního adenokarcinomu pankreatu (PDAC) je vysoce žádoucí potřeba nových biomarkerů, které by přispěly k časné diagnostice a upřesnění prognózy. Cílem této práce byla validace exprese nestinu, proteinu anterior gradient 2 (AGR2) a vyšetření plazmatických hladin vybraných mikroRNA (miRNA) jako možných biomarkerů u PDAC. Exprese nestinu byla imunohistochemicky vyšetřena na souboru 117 resekabilních PDAC a korelována s vybranými klinicko-patologickými parametry včetně perineurálního šíření. Exprese proteinu AGR2 byla studována na souboru 135 pacientů s resekabilním PDAC. Na tkáňových řezech byly imunohistochemicky vyšetřeny exprese proteinů AGR2 a mucinu 4 (MUC4) a korelovány s klinicko-patologickými údaji. K ověření cirkulujících miRNA, bylo na základě literárních údajů zvoleno 6 miRNA: miR-21-5p, miR-375, miR-155, miR-17-5p, miR-126-5p a miR-1290. Validace těchto miRNA byla provedena na souboru 25 pacientů s resekabilním PDAC před chirurgickou resekcí a u 25 zdravých jedinců. Plazmatické hladiny miRNA byly stanoveny metodou kvantitativní Real-Time PCR. Z vyšetřených 117 duktálních adenokarcinomů pankreatu bylo 79 nestin negativních (67,5 %) a 38 nestin pozitivních (32,5 %). Statisticky signifikantní korelace mezi expresí nestinu a vybranými klinicko-patologickými parametry nebyla prokázána. Stupeň diferenciace tumoru (p<0,001) a postižení lymfatických uzlin (p=0,009) potvrdily svoji roli nezávislých prognostických faktorů. Perineurální šíření bylo zaznamenáno celkem u 94 duktálních adenokarcinomů pankreatu (80,3 %), statisticky signifikantní korelace s expresí nestinu se neprokázala. Imunohistochemická analýza ukázala zvýšenou expresi proteinu AGR2 v buňkách karcinomu pankreatu ve srovnání s normálními buňkami duktů. Exprese AGR2 i MUC4 korelovala s mírou nádorové diferenciace. Obecně, dobře diferencovaná nádorová tkáň exprimovala vysoké hladiny sledovaných proteinů, středně diferencované úseky vykazovaly nižší hladiny a málo diferencované struktury pouze slabou pozitivitu, či byly zcela negativní. Avšak případy nízce diferencovaných nádorů s vyšší expresí AGR2 byly spojeny s kratší dobou přežití (p=0,01085). U všech testovaných miRNA jsme potvrdili signifikantně vyšší hladiny v krevní plazmě u pacientů s PDAC ve srovnání se zdravými kontrolami. Přitom nejvyšší statistickou významnost prokázala miR-21-5p (p<0,001, AUC>0,99). Zvýšené hladiny miR-21-5p (p=0,045) a miR-375 (p=0,013) byly významně spojené s celkovým přežitím. Byl potvrzen úzký vztah nestinu a biologického procesu duktálního adenokarcinomu pankreatu. Na rozdíl od významu sledovaných konvenčních prognostických faktorů, význam exprese nestinu jako potenciálního prognostického markeru prokázán nebyl. Současně nebyla prokázána signifikantní korelace mezi expresí nestinu v nádorových buňkách a perineurálním šířením karcinomu. Zvýšená exprese AGR2 je prediktorem horší prognózy u nízce diferencovaných duktálních adenokarcinomů pankreatu. Multivariační analýza prokázala, že miR-21-5p je významným nepříznivým prognostickým faktorem nezávislým na dalších klinických faktorech, včetně adjuvantní chemoterapie (poměr rizika 2,95, 95% CI 1,06-8,18, P <0,038).

Abstract:

There is a tremendous need for novel biomarkers for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), that would contribute to an early diagnosis and prognosis specification. The aim of this work was to validate nestin and anterior gradient 2 (AGR2) expression and plasma levels of selected microRNAs (miRNAs) as potencial PDAC biomarkers. The expression of nestin was immuhistochemically examined in 117 resectable PDAC, analyzed and correlated with clinicopathological parameters including perineural invasion (PNI). AGR2 expression was studied in a cohort of 135 patients with resectable PDAC. AGR2 and mucin 4 (MUC4) expression levels were immunohistochemicaly detected in tissue sections and correlated with clinicopathologic variables. Based on the literature search, 6 miRNAs were chosen as candidates for validation: miR-21-5p, miR-375, miR-155, miR-17-5p, miR-126-5p and miR-1290. Validation of these miRNAs was performed on cohort of 25 patients with PDAC undergoing surgical resection and 25 healthy donors. Plasma levels of miRNAs were determined using quantitative real-time PCR. Immunohistochemical analysis of nestin expression showed 79 nestin negative (67.5 %) and 38 nestin positive (32.5 %) PDACs. No significant correlations of nestin expression in tumor cells with the analyzed clinicopathological parameters were demonstrated. Tumor grade (p<0.001) and nodal status (p=0.009) proved to represent independent prognostic factors. PNI was identified in 94 PDAC (80.3 %), and did not correlate with nestin expression. Immunohistochemical analysis revealed higher AGR2 protein levels in pancreatic carcinoma cells compared to normal ductal cells. AGR2 and MUC4 expression reflected the level of cancer tissue differentiation. Generally, well-differentiated structures exhibited strong and moderate expression of both proteins, moderately-differentiated structures showed weaker expression and poorly-differentiated structures showed weak or negative expression. However, high-grade cases with higher AGR2 expression were associated with shorter survival (p=0,01085). We confirmed significantly higher levels of all tested miRNA in blood plasma of PDAC patients in comparison to healthy controls with miR-21-5p showing the highest analytical performance (p<0.001; AUC>0.99). Increased levels of miR-21-5p (p=0.045) and miR-375 (p=0.013) were significantly associated with overall survival. An intimate link of nestin to a biological process of pancreatic cancer was confirmed. The expression of nestin did not prove to be a valuable prognostic factor in contrast to conventional prognostic factors in PDAC. A correlation between nestin expression in tumor cells and PNI was not confirmed Elevated AGR2 expression predicts worse prognosis in high-grade PDAC. Multivariate analysis demonstrated that miR-21-5p is a significant unfavorable prognostic factor independent on other clinical variables including adjuvant chemotherapy (hazard ratio 2.95; 95% CI 1.06–8.18; P < 0.038).

Keywords

Duktální adenokarcinom pankreatu, nestin, AGR2, mikroRNA, imunohistochemie, perineurální invaze, plazma, prognostický faktor, klinicko-patologické korelace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 9. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 25. 2. 2019
• Supervisor: prof. MUDr. Markéta Hermanová, Ph.D.
• Reader: doc. MUDr. Leoš Křen, Ph.D., prof. MUDr. Bohuslav Melichar, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology