Signalizační modul RanGTPáz a mikrutubulární cytoskelet rostlin

Zuzana Gelová

Diplomová práce

Signaling modul of RanGTPases and microtubular plant cytoskeleton

Anotace:

Cytoskelet je buněčná struktura, které zajišťuje vnitřní organizaci buňky. Jeho součást, mikrotubuly, jsou v živočišných buňkách nukleovány z mikrotubuly organizujících center, hlavně z centrozómu. Rostlinné buňky postrádají centrozómy a nukleace mikrotubulů probíhá z disperzních center v membráně, v cytoplazmě a na již existujících mikrotubulech. V průběhu mitózy buněk živočišných jsou mikrotubuly dělícího vřeténka nukleovány z okolí kondenzovaných chromozómů na základě RanGTPázového gradientu a činností dalších proteinů jako je např. protein TPX2 (z anglického targeting protein for Xklp2). Znalosti o roli tohoto proteinu při nukleaci a organizaci mikrotubulů v acentrozomálních buňkách vyšších rostlin jsou zatím nižší, a proto byl Arabidopsis thaliana protein AtTPX2 studován v rámci předkládané diplomové práce. Předmětem práce bylo moderními technikami molekulární a buněčné biologie lokalizovat GFP fúzi AtTPX2 a to jak celého proteinu, tak jeho C-koncové domény v buňkách A. thaliana. Dalším úkolem bylo charakterizovat vztah tohoto proteinu k proteinům cytoskeletu alfa-tubulinu a gama-tubulinu. Metodou GATEWAY klonování byly připraveny N-koncově GFP značené konstrukty proteinu AtTPX2 i jeho C-koncové domény. Byly odvozeny suspenzní kultury A. thaliana ekotyp Columbia stabilně exprimující tyto konstrukty, ve kterých byla fluorescenční mikroskopií analyzována GFP exprese a lokalizace AtTPX2 proteinu i jeho C-koncové domény v buňkách. Nepřímým imunofluorescenčním barvením exprimovaných proteinů, alfa-tubulinu a gama-tubulinu v těchto suspenzích byl charakterizován vztah AtTPX2 proteinu a jeho C-koncové domény k proteinům cytoskeletu. Protein AtTPX2 i jeho doména byl během interfáze lokalizován v jádře. V průběhu mitózy byla zjištěna lokalizace na strukturách dělícího aparátu buňky a v případě celého AtTPX2 proteinu také v membránách váčků v okolí pólů vřeténka. Lokalizace ve fragmoplastu nebyla zjištěna. Analýza vztahu proteinu AtTPX2 a jeho C-terminální domény k alfa-tubulinu a gama-tubulinu ukázala kolokalizaci těchto proteinů v průběhu mitózy na mikrotubulech vřeténka, hlavně v pólových oblastech. Na rozdíl od mitózy, v procesu cytokineze nebyla pozorována asociace AtTPX2 proteinu s mikrotubuly cytokinetického aparátu fragmoplastu ani kolokalizace s gama-tubulinem v této oblasti, ale hlavní část AtTPX2 byla lokalizována v oblasti chromatinu nově vznikajících dceřiných jader. Výsledky naznačily, že AtTPX2 protein se podílí na organizaci mitotických mikrotubulů v acentrozomálních buňkách rostlin

Abstract:

The cytoskeleton prezent an important organizing principle in the cells. Microtubules as one of the most important cytoskeletal systems are nucleated from microtubule organizing centers, especially from centrosomes, in animal cells. Because of absence of centrosomes in plant cells, the microtubules are nucleated from the disperse sites that are localized with membrane, in cytosol or at the surface of microtubules fibres. During mitosis in mammalian cells the spindle is organized via RanGTP gradient what is formed around chromosomes, TPX2 (targeting protein for Xklp2) takes part in this process. As much more limited data are available on the role of TPX2 protein in acentrosomal plant cells we decided to characterize TPX2 protein of Arabidopsis thaliana. The aim of this work was localize GFP vision of AtTPX2 protein and its C-terminal part in A. thaliana cells by modern techniques of molecular and cell biology. The second part of work was to characterization interaction between AtTPX2 protein and its C-terminal domain and other cytoskeletal proteins alpha-tubulin and gamma-tubulin. N-terminal fusion of GFP-AtTPX2 protein and its GFP-C-terminal part of molecule were prepared by GATEWAY cloning technique. The suspension cultures of A. thaliana cells expressing GFP-AtTPX2 protein and its GFP-C-terminal part of molecule were derived, and localization of expressed proteins was studied during cell cycle progression in cells in vivo. Alternatively imunofluorescence labelling of both proteins was applied to study their colocalization with microtubular cytoskeleton and gamma-tubulin. Our data showed that both entite AtTPX2 molecule as well as C-terminal part of molecule were localize in intephase nucleus. During mitosis the localization of AtTPX2 protein and C-terminal part of molecule with spindle microtubules was observed. The whole AtTPX2 protein was localized with membrane vesicles in the vicinity of acentrosomal spindle poles. Unlike to mitotic spindle, AtTPX2 localization with microtubules of cytokinetic apparatus phragmoplast was not detected. Instead, the protein was observed on poles since anaphase to telophase and entered newly formed nuclei. The localization of whole AtTPX2 protein and its C-terminal part in cytokinesis was different; while the whole AtTPX2 protein colocalized with alpha-tubulin and gamma-tubulin in the vicinity of chromatin, AtTPX2 C-terminal domain colocalized with alpha-tubulin and gamma-tubulin associated with phragmoplast. Our data suggest that AtTPX2 protein is involved in organization of mitotic microtubular arrayes in acentrosomal plant cells

Klíčová slova

cytoskelet, nukleace mikrotubulů, RanGTP, TPX2, alfa-tubulin, gama-tubulin, Arabidopsis thaliana

Keywords

cytoskeleton, microtubular nucleation, RanGTP, TPX2, alpha-tubulin, gamma-tubulin, Arabidopsis thaliana

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2009
• Vedoucí: Pavla Binarová
• Oponent: Ondřej Plíhal

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie