Molekulární základ mutací polyvalentního stafylokokového bakteriofága 812 týkajících se jeho rozmezí hostitele

Mgr. Petr Kašpárek, Ph.D.

Disertační práce

Molecular basis of mutations of the polyvalent staphylococcal bacteriophage 812 related to its host range

Anotace:

Bakteriofág 812 je polyvalentní virulentní bakteriofág řazený do čeledi Myoviridae. Má velmi široké rozmezí hostitele, které může být rozšířeno spontánními mutacemi až na 95 % kmenů S. aureus a 43 % kmenů dalších koaguláza pozitivních a koaguláza negativních druhů stafylokoků. Díky širokému rozmezí hostitele je vhodným kandidátem pro fágovou terapii, která se slibně rozvíjí jako alternativa léčby antibiotiky. V této práci byly identifikovány a blíže charakterizovány mutační změny v genomu u vybraných mutant fága 812 v rozmezí hostitele. U mutanty 812F1 došlo při nepřesném vyštěpení intronu z genu pro endolyzin k deleci části kódující sekvence pro endolyzin. U mutant 812i, 812b, 812p a 812F3 byla zjištěna delece části genu pro strukturní protein ORF8 v důsledku restrukturalizace způsobené zařazením intronu. Tato mutace byla nalezena i u blízce příbuzných stafylofágů j131 a U16. U mutant 812i, 812b, 812p a 812F3 byl nalezen intron v genu pro RecA protein. U mutanty 812b, 812F3 a 812g byl popsán inzert v nekódující oblasti genomu v restrikčním fragmentu PstI-O. Sekvence lytického modulu, části „head-tail“ modulu a části replikačního modulu fága 812 byly uveřejněny v GenBank pod čísly: EF136581-EF136589. Sekvence restrukturalizované terminální oblasti genomu fága 812 byla uveřejněna pod čísly AY842850-AY842851. Získané sekvence kapsidového „head-tail“ modulu fágů 812 a Twort byly použity pro vývoj metody multiplex PCR pro identifikaci a klasifikaci stafylokokových fágů. Ze získaných nukleotidových sekvencí byly odvozeny sekvence fágových proteinů, které byly použity i pro identifikaci proteinů podílejících se na stavbě kapsidového obalu fága 812. Pomocí peptidového mapování založeného na hmotnostní spektroskopii bylo identifikováno 24 proteinů a některým byla přiřazena funkce. Výsledky analýzy mutací v rozmezí hostitele i analýzy proteomu přispívají k charakterizaci genetických faktorů ovlivňujících rozmezí hostitele polyvalentních stafylokokových bakteriofágů. Mutace u bakteriofágů, které rozšiřují jejich rozmezí hostitele, jsou významné z hlediska použití bakteriofágů ve fágové terapii bakteriálních infekcí. Základní znalosti faktorů účastnících se na procesu infekce, jako je složení kapsidového obalu nebo molekulární podstata změny rozmezí hostitele, je nezbytným předpokladem racionalizaci a dalšího vývoje fágové terapie a jejího účinného a bezpečného použití v praxi.

Abstract:

Bacteriophage 812 is a polyvalent virulent phage belonging to the family Myoviridae. Mutations extend its host range in up to 95 % of Staphylococcus aureus strains and 43 % of strains of different coagulase-positive and coagulase-negative Staphylococcus species. Thanks to its broad host range, phage 812 is an ideal candidate for the phage therapy that promisingly develops as an alternative to the antibiotic therapy. Mutational changes in the genome of several previously isolated host-range mutants of phage 812 were identified and described in this study. Host-range mutant 812F1 harbors a deletion in endolysin gene that arose together with intron excision. Mutants 812i, 812b, 812p and 812F3 harbor deletion in the structural gene orf8 that results from a genome rearrangement that is associated with intron insertion. This rearrangement was also detected in the genome of the closely related phages, U16 and j131. Another intron was discovered in the recA gene in mutants 812i, 812b, 812p and 812F3. An insertion was found in a non-coding region of the restriction fragment PstI-O of mutants 812b, 812F3 and 812g and phages U16 and j131. Nucleotide sequences of the lytic module, the partial head-tail module and the parital replication module were submitted to GenBank under acc. no. EF136581-EF136589. Nucleotide sequence of the rearranged terminal genomic region has acc. no. AY842850-AY842851. Sequences of the head-tail module of phages 812 and Twort were used for development of a multiplex PCR method for identification and classification of staphylococcal phages. Deduced protein sequences were used for identification of proteins forming capsid of phage 812. Altogether 24 capsid proteins were identified by means of MALDI MS peptide mass fingerprinting. Results of the mutational analysis and the proteome analysis contribute to description of factors affecting the host range of polyvalent staphylococcal bacteriophages. The results are also important for rationalization and development of phage therapy and for its effective practical applications.

Klíčová slova

Staphylococcus bacteriophage, host range mutations, genome rearrangements, phage introns

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 2. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 2. 2007
• Vedoucí: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie