Bioinformatické zpracování sekvenačních dat Eudiplozoon nipponicum se zaměřením na predikci a charakterizaci funkčně významných molekul.

Mgr. Jiří Vorel, Ph.D.

Doctoral thesis

Bioinformatic processing of sequencing data of Eudiplozoon nipponicum with a focus on the prediction and characterisation of functionally important molecules

Abstract:

Monogenea představují druhově nejpočetnější a hostitelsky nejspecifičtější skupinu především rybích cizopasníků v rámci skupiny Neodermata. I přes jejich zásadní ekologický a ekonomický význam jsou studováni především z hlediska taxonomie a morfologie a na úrovni populačních a evolučních charakteristik. Komplexní omické studie popisující jaderné genomy, transkriptomy jednotlivých vývojových stádií a proteomy (např. exkrečně-sekreční nebo tkáňově specifický), až na několik výjimek neexistují. Přitom pouze tyto studie vedou ke vzniku robustních sekvenčních databází, pomocí kterých je možné porozumět biochemické a molekulárně biologické podstatě těchto organismů a vytipovat důležité proteinové molekuly zapojené do interakce hostitel-parazit, kde sehrávají významnou úlohu v procesech, jako je např. vyhledávání vhodného hostitele ve vnějším prostředí, inhibice hemostázy, modulace imunity hostitele, potlačení srážení krve hematofágními parazity, trávení makromolekul a vstřebávání živin. Předložená dizertační práce se věnuje bioinformatickému (in silico) zpracování sekvenačních genomických a transkriptomických dat, vytvoření genomového, mitogenomového a transkriptomického sestavení (tzv. assembly) de novo, funkční anotaci predikovaných proteinů, molekulárních funkcí a biochemických drah a následné charakterizaci vybraných proteinových molekul mající zásadní funkce v biologii experimentálního organismu Eudiplozoon nipponicum (Monogenea, Diplozoidae), hematofágního ektoparazita kapra obecného Cyprinus carpio. Práce dále popisuje složení exkrečně-sekrečního proteomu, tzv. sekretomu, dospělých červů a představuje některé proteiny přímo interagující s rybím hostitelem. Celek 50,81 Gbp genomických sekvenačních dat (Illumina a Oxford Nanopore čtení) byl vygenerován, bioinformaticky zpracován a sestaven do podoby genomu o délce 0,94 Gbp, který je složen z 21 044 kontigů (N50 = 87,07 kbp), což představuje 57 % celkově odhadované velikosti genomu (~1,64 Gbp), s významně rozšířenými repetitivními oblastmi (~64 % sestavené délky). V genomu bylo predikováno 36 626 genů s 33 031 transkripty kódujících proteiny. Z genomických sekvenačních dat se také podařilo sestavit kompletní cirkulární mitochondriální genom o délce 17 038 bází. Související studie zabývající se de novo sestavením transkriptomu dospělců E. nipponicum (kombinace 324 941 nepárových Roche 454 a 149 697 864 párových Illumina čtení) sestavila 37 062 transkriptů kódujících proteiny a pro 19 644 z nich (53,0 %) byly nalezeny sekvenční homology. S využitím hmotnostně spektrometrické analýzy exkrečně-sekrečního proteomu bylo identifikováno 721 proteinových molekul sekretovaných dospělci do vnějšího prostředí; mezi nimiž figurují i molekuly s imunomodulačními a protizánětlivými funkcemi a vlastnostmi degradovat makromolekuly hostitele. Ačkoliv množství omických dat a charakterizovaných molekul parazitů třídy Monogenea v nedávné době významně vzrostlo, z pohledu funkční genomiky se stále jedná o značně opomíjené organismy, a to i přes jejich evidentní ekologický a ekonomický význam. Eudiplozoon nipponicum je doposud nejprostudovanější zástupce třídy Monogenea na úrovni molekulární biologie a v současnosti představuje organismus s největším genomem v rámci parazitických ploštěnců. Výsledky prezentované v této práci představují významný příspěvek ke znalostem parazitů skupiny Monogenea, přičemž nově vzniklé databáze – genomická, transkriptomická, sekretomická, mají značný potenciál sloužit jako zdroj informací pro další studium těchto organismů.

Abstract:

Class Monogenea represents the most species-rich and host-specific group of predominantly fish parasites within Neodermata. Despite their ecological and economic importance, they are primarily studied in terms of taxonomy and morphology and for the population and evolutionary characteristics. Comprehensive omics studies targeting the description of nuclear genomes, stage-specific transcriptomes, and proteomes (e.g., excretory-secretory or tissue-specific) are neglected with a few exceptions. Only these comprehensive studies lead to the creation of robust sequential databases, using which it is possible to understand the molecular nature and biochemistry of monogenean parasites and identify important protein molecules involved in the host-parasite interaction, such as searching for a host, inhibition of hemostasis, modulation of host immunity, suppression of blood clotting by hematophagous parasites, digestion of macromolecules, and absorption of nutrients. The presented dissertation thesis is focused on bioinformatic (in silico) processing of genomic and transcriptomic sequencing data, de novo genome, mitogenome and transcriptome assembly, functional annotation of predicted proteins, molecular functions, and biochemical pathways and further characterisation of selected functionally important protein molecules in the biology of experimental organism Eudiplozoon nipponicum (Monogenea, Diplozoidae), a haematophagous ectoparasite of common carp Cyprinus carpio. Furthermore, this work characterises the composition of adult worms’ excretory-secretory proteome, so-called secretome, and presents proteins interacting with the fish host. 50.81 Gbp of genomic sequencing data (Illumina and Oxford Nanopore reads) was generated, bioinformatically processed, and assembled into the genome draft of length 0.94 Gbp, consisting of 21,044 contigs (N50 = 87.07 kbp). The final assembly represents 57% of the estimated genome size (~1.64 Gbp), with abundantly widespread repetitive and low-complexity regions (~64% of assembled length). In total, 36,626 predicted genes encode 33,031 protein-coding transcripts. A circular mitochondrial genome of 17,038 bp was also assembled from the genomic sequencing data. Another study dealing with the de novo assembly of the E. nipponicum adult worms’ transcriptome (assembled from 324,941 Roche 454 single-end and 149,697,864 Illumina paired-end reads) produced 37,062 protein-coding transcripts, and for 19,644 of them (53.0%) were identified sequential homologues. Mass spectrometry analysis of excretory-secretory proteome identified 721 protein molecules secreted by adults to the outer environment, predominantly with immunomodulatory and anti-inflammatory functions and the ability to digest host macromolecules. Although the amount of omics data and the number of characterised molecules of monogenean parasites have recently increased, monogeneans are still neglected organisms from the point of view of functional genomics, even despite their evident ecological and economic importance. To date, E. nipponicum is the most studied monogenean representative on the level of molecular biology and currently represents an organism with the largest genome within parasitic helminths. Results presented in this thesis represent an important milestone with a significant contribution to monogenean research, and created databases (genomic, transcriptomic and secretomic) have a considerable potential to serve as a source of information for further research of these organisms.

Keywords

Monogenea, Eudiplozoon nipponicum, NGS, nanopórové sekvenování, sestavení genomu, genová predikce, anotace, transkriptomika, proteomika, mitochondriální genom, nanopore sequencing, genome assembly, gene prediction, annotation, transcriptomics, proteomics, mitochondrial genome

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 3. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 20. 4. 2023
• Supervisor: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.
• Reader: Dr. Mark Robinson, MSc. Astrid Sibylle Holzer, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Ecological and Evolutionary Biology / Parasitology