Studium buněčného stresu u bakterií pomoci moderních metod kvantitativní proteomiky

Bc. Vendula Pernikářová

Diplomová práce

The study on the cell stress in bakteria using modern method of quantitative proteomics

Anotace:

Redoxní stres u fakultativně anaerobních bakterií může být příčinou změn v regulaci genové exprese, které se projevují na úrovni proteinů. Tyto změny v hladinách jednotlivých proteinů mohou být sledovány pomocí moderních proteomických metod, které jsou schopny současné identifikace a kvantifikace velkého množství proteinů s relativně vysokým pokrytím proteomu. Diplomová práce je zaměřena na studium proteinu FerB a jeho role v redoxním stresu u aerobně rostoucí bakterie Paracoccus denitrificans s cílem identifikovat proteiny korelující s hladinou FerB a proteiny, u nichž byla změna způsobená redoxním stresem ovlivněna mutací v genu ferB. Tyto biologické změny byly sledovány pomocí nové vysokorozlišovací proteomické techniky, která je založena 3DLC-MS/MS analýze s kvantifikací proteinů pomocí iTRAQ značení. Experiment byl založen na sledování změn hladin proteinů u divokého kmene a FerB- mutantního kmene s a bez působení methylviologenu. Proteomická data byla vnitřně validována zjištěním, že hladina proteinu FerB byla nízká u FerB- mutatního kmene a vysoká u divokého kmene. Zároveň bylo 3DLC-MS/MS analýzou identifikováno velké množství proteinů, u nichž změna jejich hladin souvisí jak s mutací v genu ferB, tak s působením methylviologenu jako redoxního stresoru. Kromě proteinu FerB byl identifikován transkripční regulátor XRE rodiny, jehož hladina byla snížená u FerB- mutantního kmene oproti divokému kmeni. Peptidáza C14 a membránový efflux protein patřily k proteinům, u nichž byla naopak zvýšená jejich hladina u mutantního kmene oproti divokému kmeni. Dále bylo identifikováno mnoho proteinů, jejichž hladina byla zvýšena vlivem působení redoxního stresu. Do této skupiny patřila řada transmembránových proteinů a také proteinů kódovaných geny na vzájemně navazujících lokusech, které by mohly být součástí jednoho operonu. Jako proteiny, jejichž hladina byla vlivem redoxního stresu zvýšena pouze u divokého kmene, byly identifikovány uracil-DNA glykosyláza, protein s β-laktamázovou doménou a necharakterizovaný protein. Mezi proteiny, jejichž hladina byla vlivem působení methylviologenu zvýšena pouze u FerB- mutantního kmene, patřily transkripční regulátory ArsR a AbrB, NapD podjednotka periplazmatické nitrátreduktázy a řada necharakterizovaných proteinů s dosud neznámou funkcí.

Abstract:

The redox stress in facultative anaerobic bacteria can cause changes in gene expression observable on proteins level. These changes can be monitored using modern proteomics methods of proteomics which are able to identify and quantify a high number of proteins with significantly high proteome coverage. The thesis was focused on studying the FerB protein and its role in redox stress caused by methylviologen in aerobically grown bacterium Paracoccus denitrificans. Another aim was to identify proteins that were related to the FerB level and proteins with mutation in the ferB gene. These biological changes were studied using a new high-resolution technique based on 3DLC-MS/MS with iTRAQ labeling. Changes of proteins level in wild-type and FerB- mutant strain were observed. The analysis of proteome confirms that the level of FerB protein is low in FerB- mutant strain and high in wild-type strain. The 3DLC-MS/MS analysis also identified number of proteins whose levels were changed by mutation in ferB gene or using methylviologen as redox stressor using. Except for FerB protein there was a transcriptional regulator of XRE family identified whose level was decreased in mutant strain unlike in wild-type strain. The level of Peptidase C14 and membrane efflux protein was increased in mutant strain unlike in wild-type strain. Also there were a lot of proteins identified whose high level was caused by methylviologen. This protein group includes transmembrane proteins and proteins whose genes are on subsequent loci. These genes can be part of one operon. The level of uracil-DNA glykosylase, β-laktamase domain proteins and uncharacterized protein was increased by methylviologen only in wild-type strain. Transcriptional regulators ArsR and AbrB, NapD periplazmatic nitratereduktase and many uncharacterized proteins belong to a group of proteins whose level was increased by methylviologen only in mutant strain. The function of most of the proteins is not clear and further research is required to explain their purpose.

Klíčová slova

Kvantitativní proteomika, 3DLC-MS/MS, Paracoccus denitrificans, protein FerB

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2013
• Vedoucí: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie