Identifikace jedlých hub pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF.

Bc. Marika Aronová

Master's thesis

Identification of edible mushrooms by MALDI-TOF mass spectrometry

Abstract:

Identifikace hub je v současné době omezena na porovnávání podle morfologických znaků, což vyžaduje zkušeného mykologa, nebo na identifikaci na základě analýzy DNA, která taktéž vyžaduje odbornost pracovníků, a navíc je finančně i časově náročná. Identifikace pomocí MALDI nabízí levnou, rychlou a snadnou alternativu. Jedná se hmotnostní spektrometrii, kdy jsou rozlišována specifická hmotnostní spektra proteinů organismu. Princip určování druhů pomocí MALDI spočívá ve vytvoření knihovny referenčních spekter pro daný druh, případně kmen. Spektra neznámého vzorku jsou porovnány s knihovnou a program vyhodnotí shodu, která je vyjádřena logaritmickým skóre 0 – 3. Metoda je v praxi používána v mikrobiologii pro identifikaci bakterií, kvasinek a vláknitých hub, ovšem metody identifikace vyšších hub pomocí MALDI ještě nejsou zcela prozkoumány a pro identifikaci není standartní postup přípravy vzorku a nejsou dostupné knihovny referenčních spekter hub. V této diplomové práci byla vytvořena domácí knihovna ze spekter 56 známých kmenů hub rodu Pleurotus. Kmeny náležely 9 druhům. Nejdříve byla provedena optimalizace extrakční metody, kdy byly vyhodnoceny jako nejvhodnější přípravy vzorku: extrakce etanolem a kyselinou mravenčí shomogenizací voscilačním mlýně, a přímý přenos na destičku. Všechny vzorky byly analyzovány oběma způsoby a následně byly vytvořeny dvě knihovny. Na základě shlukové analýzy byla zřetelná rozlišitelnost druhů v obou případech. Aplikovatelnost MALDI na identifikaci na druhové úrovni byla úspěšně ověřena identifikací slepých vzorků. Referenční spektra knihoven byla mezi sebou porovnána a byla zjišťována kompatibilita spekter získaných ze dvou metod přípravy vzorku, při porovnání spekter došlo ke 100% úspěšnosti správného určení druhu a 51 % správného určení kmenu. Metoda MALDI je vhodná pro identifikaci hub rodu Pleurotus na druhové úrovni. Nejlepším protokolem přípravy vzorku je přímý přenos buněk na destičku, což metodu činí ještě rychlejší a levnější. Další výhodou je, že je přímý přenos buněk použitelný i v případě, že by knihovna referenčních spekter hub nabízená komerčními systémy MALDI biotyperu byla tvořena spektry získanými ze vzorků extrahovaných kyselinou mravenčí.

Abstract:

The identication of mushrooms is currently limited to comparisons based on morphological features, whitch requires an experienced mycologist. Other option is an identification based on DNA analysis, whitch also requires skilled workers, these methods are expensive and time consuming. MALDI identification offers a cheap, fast and easy alternative. It is mass spektrometry based on specific protein spektra of organism, The principle of MALDI biotyping consists in creating a library of reference spektra for species or strain, the spektra of an unknown sample are compared with the library and the program calculate similarity, which is expressed by a logarithmic score of 0-3. The method is used in practice inmicrobiology for the identification of bacteria, yeast and filamentous fungi. The indentification of mushrooms by MALDI has not been fully investigated and the sample preparation protocol is not optimalized for the method and there are not available libraries of reference spektra of mushrooms. In this diploma thesis was created a in-house database of the spektra of 56 known strains of the genus Pleurotus, whitch belonged to 9 species. First, the optimization of the extrakction was performed, where we evaluated as the most suitable sample preparation: extraction with ethanol and formic acid with homogenization in an oscillating mill, and direct thransfer of cells to the target – intact cell. All samples were analyzed by both methds and two libraries were created. Based on a cluster analysis, the difference of species in both protocols was clear.The applicability of MALDI for identification at the species level was succesfully verified by the identification of blank samples. The reference spektra of the libraries were compared with each other and the compatibility of the spektra obtained from two sample preparation protocols was determined.When compared the spektra, there was a 100% success of the correct determination of the species and a % of the correct determination of the strain. The MALDI method is suitable for identification of fungi of the genus Pleurotus at the species level, a sufficient and in fact the best protocol for sample preparation is intact cell transfer to the target, which makes the method even faster and cheaper. Another advantage is that intact cell transfer is usable even if the library of refence spektra offered by commercial MALDI biotyper systems would be obtained from the samples extracted with formic acid.

Keywords

MALDI-TOF, Pleurotus, jedlé houby, biotyper

Keywords

MALDI-TOF, Pleurotus, edible mushroom, biotyper

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Matěj Božik

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Nutrition and Foodstuffs / Nutrition and Foodstuffs