Detekce galaktosylových struktur zony pellucidy oocytů prasete

Bc. Veronika Dřevová

Master's thesis

Detection of galaktosyl structures in the zona pellucida of porcine oocytes

Abstract:

Oogeneze je složitý komplexní děj, při kterém dochází k vývoji oplození schopného oocytu. Oocyt prochází během oogeneze řadou strukturních a funkčních změn. Dochází například k syntéze extracelulárního glykoproteinového obalu zony pellucidy. Zona pellucida se u prasat skládá ze 3 glykoproteinů: ZP2, ZP3 a ZP4, které podstupují řadu posttranslačních modifikací jako jsou glykosylace, sializace a sulfatace. Tyto posttranslační modifikace jsou vysoce heterogenní a mezidruhově odlišné. Právě rozdíly v posttranslačních modifikacích rozhodují o druhově specifickém rozpoznání gamet a jsou klíčové pro vazbu spermie na oocyt. Cílem této diplomové práce bylo ověřit hypotézu, že během meiotického zrání prasečích oocytů dochází k redistribuci galaktosylových struktur na zoně pellucidě prasečích oocytů. K detekci galaktosylových struktur byly použity lektiny specificky se vázající na galaktosylové struktury (RCA I a PNA). RCA I se specificky váže na sacharidové sekvence ve vazbě β-D-Gal-(1–4)-D-GlcNAc, zatímco PNA se specificky váže na sacharidovou sekvenci ve vazbě β-D-Gal-(1-3)-D-GalNAc. Realizovanými experimenty byla potvrzena vazba lektinů RCA I i PNA na zonu pellucidu prasečích oocytů v různých stádiích meiotického zrání, konkrétně ve stádiu zárodečného váčku (GV), ve stádiu metafáze prvního meiotického dělení (MI) a ve stádiu metafáze druhého meiotického dělení (MII). Dle statistických vyhodnocení nebyly u lektinu RCA I pozorovány statisticky významné rozdíly v relativní intenzitě signálu daného lektinu mezi jednotlivými sledovanými skupinami oocytů. Nicméně zde byl patrný trend, kdy pravidelně docházelo k poklesu relativní intezity signálu lektinu RCA I při přechodu ze stádia MI do stádia MII. U lektinu PNA byl naopak pozorován statisticky významný rozdíl mezi všemi skupinami. Nejvyšší relativní intenzita signálu lektinu PNA byla patrna u skupiny oocytů ve stádiu GV. Statisticky významně nižší relativní intenzita signálu lektinu PNA byla pozorována ve skupině oocytů ve stádiu MI a k dalšímu statisticky významnému poklesu došlo i mezi skupinami oocytů ve stádiu MI a MII. Je pravděpodobné, že během meiotického zrání dochází k odštěpování galaktosylových struktur ze zona pellucida prasečího oocytu a tím může docházet k odhalování epitopů důležitých pro vazbu spermie na oocyt. Pro potvrzení této hypotézy by bylo potřeba realizovat podrobnější experimenty s větší škálou sledovaných lektinů.

Abstract:

Oogenesis is a complex, intricate process that results in the development of a fertilizable oocyte. The oocyte undergoes a series of structural and functional changes during oogenesis. For example, the synthesis of the extracellular glycoprotein envelope of the zona pellucida occurs. The zona pellucida in pigs consists of 3 glycoproteins, ZP2, ZP3 and ZP4, which undergo a series of post-translational modifications such as glycosylation, sialylation and sulphation. These post-translational modifications are highly heterogeneous and interspecies distinct. It is the differences in posttranslational modifications that determine species-specific gamete recognition and are crucial for sperm-oocyte binding. The aim of this thesis was to test the hypothesis that during meiotic maturation of porcine oocytes, redistribution of galactosyl structures occurs in the zona pellucida of porcine oocytes. Lectins that specifically bind to galactosyl structures (RCA I and PNA) were used to detect galactosyl structures. RCA I specifically binds to the carbohydrate sequence in the β-D-Gal-(1-4)-D-GlcNAc linkage, whereas PNA specifically binds to the carbohydrate sequence in the β-D-Gal-(1-3)-D-GalNAc linkage. The experiments confirmed the binding of RCA I and PNA lectins to the zona pellucida of porcine oocytes at different stages of meiotic maturation, namely at the germinal vesicle (GV) stage, at the metaphase stage of the first meiotic division (MI) and at the stage of the second meiotic division (MII). According to the statistical evaluations, no statistically significant differences in the relative signal intensity of the lectin were observed for the RCA I lectin between the different groups of oocytes studied. However, there was a clear trend where there was a regular decrease in the relative signal intensity of RCA I lectin during the transition from MI to MII stage. In contrast, a statistically significant difference was observed for the PNA lectin between all groups. The highest relative signal intensity of the PNA lectin was seen in the group of oocytes at the GV stage. A statistically significantly lower relative intensity of the PNA lectin signal was observed in the MI stage oocyte group, and a further statistically significant decrease occurred between the MI and MII stage oocyte groups. It is likely that during meiotic maturation, galactosyl structures are cleaved from the zona pellucida of the porcine oocyte, and this may lead to the discovery of epitopes important for sperm binding to the oocyte. To confirm this hypothesis, more detailed experiments with a larger range of lectins would be needed.

Keywords

galaktosylace, lektiny, oocyt, prase, zona pellucida

Keywords

galactosylation, lectins, oocytes, zona pellucida, pig

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 21. 5. 2024
• Supervisor: Mgr. Ing. Tereza Krejčová, Ph.D.
• Reader: Marta Homutová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology