Využitie bioenkapsulácie pre produkciu katelicidínu LL-37 v endosperme jačmeňa

Mgr. Veronika KÁBRTOVÁ

Master's thesis

The use of bioencapsulation for the production of cathelicidin LL-37 in barley endosperm

Anotácia:

Teoretická časť diplomovej práce obsahuje literárnu rešerš na tému antimikrobiálne peptidy a ich diverzitu, mechanizmus účinku a bakteriálnu rezistenciu s následným zameraním na ľudský antimikrobiálny peptid katelicidín LL-37. Okrem toho sú v teoretickej časti popísané štruktúry, ktoré môžeme nájsť v endosperme jačmeňa, ako sú napríklad vakuoly skladujúce proteíny alebo proteínové telieska. V poslednej časti sú popísané rôzne rastlinné heterológne expresné systémy na báze listov a semien, so zameraním na ich výhody a nevýhody použitia a purifikačné stratégie rôznych rekombinantných proteínov využívajúce afinitné značky alebo nechromatografické metódy. V experimentálnej časti diplomovej práce bola najprv overená funkčnosť signálneho peptidu legumínu B4 vo fúzii s GFP sekvenciou pomocou tranzientnej expresie v listoch tabaku a ich následným pozorovaním pod fluorescenčným a konfokálnym mikroskopom. Okrem toho boli dva konštrukty obsahujúce ľudský katelicidín LL-37 spolu s ďalšími fúznymi značkami klonované najprv do vstupného vektora pENTR1A_Hana a následne pomocou GATEWAY rekombinantnej technológie do expresného vektora pBract209, vhodného na expresiu v endosperme jačmeňa. Vrámci testovania a overovania expresie a možností purifikácie katelicidinových proteínových fúzií bol vybraný konštrukt PMK-RQ:LL-37 S8 a s týmto bola uskutočnená tranzientná expresia v listoch tabaku. Nakoniec bola táto stratégia zatransformovaná pomocou baktérie Agrobacterium tumefaciens do listov tabaku a následne purifikovaná využitím fúznych značiek DAMP4 a y-zeín. Optimalizovaný bol krok extrakcie a následný purifikačný krok pomocou teplotného alebo etanolového zrážania proteínov. Purifikačné kroky boli v tejto práci vyhodnocované pomocou metódy Western blot za použitia anti-LL-37 protilátky.

Abstract:

The theoretical part of the diploma thesis contains a review of existing literature on the topic of antimicrobial peptides and their diversity, mechanism of action, and bacterial resistance with a subsequent focus on the human antimicrobial peptide cathelicidin LL-37. Also, the theoretical part describes the structures that can be found in the barley endosperm, such as protein storage vacuoles or protein bodies. The last part describes various plant heterologous expression systems based on leaves and seeds, focusing on their advantages and disadvantages of use and purification strategies of various recombinant proteins using affinity tags or non-chromatographic methods. In the experimental part of the diploma thesis, the functionality of the signal peptide legumin B4 fused with the GFP sequence was first verified by transient expression in tobacco leaves and their subsequent observation under fluorescence and confocal microscope. Besides, two constructs containing human cathelicidin LL-37 together with other fusion tags were first cloned into the entry vector pENTR1A_Hana and then using GATEWAY recombinant technology into the expression vector pBract209, suitable for expression in barley endosperm. As a part of testing and verification of expression and purification possibilities of cathelicidin protein fusions, the construct PMK-RQ:LL-37 S8 was chosen and with this construct transient expression was performed in tobacco leaves. Finally, this strategy was transformed into tobacco leaves using Agrobacterium tumefaciens and subsequently purified using the DAMP4 and y-zein fusion proteins. The extraction step and the subsequent purification step by thermal or ethanol protein precipitations were optimized. All purification steps were evaluated by means of Western blotting using anti-LL-37 antibody.

Kľúčové slová

LL-37, GFP, tabak, jačmeň, DAMP4, y-zein, LeB4

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 5. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 6. 2020
• Vedúci: RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry