Studium aktivního místa aldehyddehydrogenasy 2A z mechu Physcomitrella patens

Bc. Tereza LIBIGEROVÁ

Diplomová práce

Study on the active site of aldehyde dehydrogenase 2A from moss Physcomitrella patens

Anotace:

Tato diplomová práce se zabývá studiem aktivního místa aldehyddehydrogenasy 2A (ALDH2A) z mechu Physcomitrella patens. Teoretickou část tvoří rešerše znalostí o mechu P. patens, nadrodině rostlinných aldehyddehydrogenas, rodině rostlinných aldehyddehydrogenas 2 a metabolismu aldehydů. V praktické části byla provedena místně-řízená mutageneze genu PpALDH2A, exprese mutantů v Escherichia coli a purifikace rekombinantních proteinů afinitní chromatografií. U všech rekombinantních variant PpALDH2A byla ověřena sekundární struktura a teplotní stabilita. Dále byla studována jejich substrátová specificita k vybraným alifatickým a aromatickým aldehydům. Pro dva nejvýznamnější substráty byly změřeny saturační křivky a určeny hodnoty Km, Vlim a katalytická účinnost (Vlim/Km). Ve výsledcích je diskutován význam jednotlivých aminokyselinových reziduí v aktivním místě enzymu.

Abstract:

The diploma thesis is focused on a study of the active site of aldehyde dehydrogenase 2A from moss Physcomitrella patens. The theoretical part summarizes the knowledge of the moss P. patens, plant aldehyde dehydrogenase superfamily, plant aldehyde dehydrogenase from family 2 and metabolism of aldehydes. The practical part is aimed at site-directed mutagenesis of PpALDH2A gene, mutant expression in Escherichia coli and purification of recombinant proteins by affinity chromatography. Secondary structure and thermal stability of recombinant variants of PpALDH2A were verified. Moreover, substrate specificity towards aliphatic and aromatic aldehydes was studied. Saturation curves for the two most significant substrates were measured and kinetic parameters Km, Vlim and a catalytic efficiency (Vlim/Km) were determined. A significance of the individual amino acid residues in the active site of enzyme is discussed in results.

Klíčová slova

Aldehyddehydrogenasa 2A, Physcomitrella patens, metabolismus aldehydů, mutageneze, enzymová kinetika

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 28. 5. 2018
• Vedoucí: Mgr. David Kopečný, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie