Vliv povrchového náboje elicitinů na biologickou aktivitu

Bc. Martin Solanský

Master's thesis

The role of elicitins surface charge on biological activity

Abstract:

Elicitiny jsou rodina malých proteinů se sterol-vazebnou aktivitou sekretovaných oomycetami rodů Phytophthora a Pythium. V několika rostlinách vyvolávají hypersenzitivní odpověď a systémově získanou rezistenci. Na základě jejich pI, které vzájemně souvisí s jejich nekrotickou aktivitou, jsou klasifikovány na α-elicitiny s 1-3 lyzinovými zbytky nebo vice nekrotizující β- elicitiny s 6-7 lyzinovými zbytky. Tato práce se zabývá vlivem, který mají vybrané lyzinové zbytky a jejich zaměnění s následnou změnou povrchového náboje, na stabilitu proteinu a biologickou aktivitu ve smyslu vyvolávat brzkou obrannou odpověď, jako je produkce reaktivních forem kyslíku a endocytóza. Dvě mutantní formy β-elicitinu kryptogeinu, K48/94T a K61T/N70D/D72E, byly připraveny metodou místně řízené mutageneze a vyprodukovány v expresním systému Pichie pastoris. Výsledky experimentu s dvěma mutantními formami kryptogeinu se zaměněnými lyzinovými zbytky potvrdily vliv povrchového náboje na schopnost přenosu sterolů i na schopnost vyvolat brzkou obranou odpověď. Zajímavé výsledky experimentu s mutantem K61T/N70D/D72E ukázaly, že tento mutant vyvolával endocytózu i přes to, že nevyvolával produkci ROS, což je v rozporu s předchozími předpoklady vztahu těchto dvou dějů. Kromě toho, u mutantu K61T/N70D/D72E byla potvrzena funkce molekulárního stabilizačního vzoru D70/E72.

Abstract:

Elicitins are a family of small proteins with sterol-binding activity secreted by oomycetes species Phytophthora and Pythium. They are inducing hypersensitive response and systemic acquired resistance in several plants. On the basis of pI, which correlates well with their necrotic ability, they are classified as either α-elicitins with 1-3 lysine residues or more necrotic (50- to 100-fold) more β- elicitins with 6-7 lysine residues. In this study influence of selected lysine residues and consequential change of surface charge on protein stability and biological activity in terms of ability to induce early defence response involving the production of reactive oxygen species and induction of endocytosis was studied. Two mutant forms of β-elicitin cryptogein, K48T/K94T and K61TN70D/D72E, were done by site-directed mutagenesis and expressed in Pichia pastoris expression system. Results of experiments with two mutant forms of cryptogein, with substituted lysine residues, confirmed that elicitin surface charge has an effect on sterol transfer ability and also on induction of early defence events. Interestingly, endocytosis experiment with mutantK61T/N70D/D72E showed ability to trigger endocytosis with almost no induction ROS production. This observation is in conflict with previously assumed relation of those two events. Moreover, functionality of stabilizing molecular pattern D70/E72 in K61T/N70D/D72E triple mutant was confirmed.

Keywords

elicitiny, kryptogein, rostlinná obrana, reaktivní formy kyslíku, endocytóza, přenos sterolů, Nicotiana tabacum, Pichia pastoris, elicitins, cryptogein, plant defence, reactive oxygen species, endocytosis, sterol transfer

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2014
• Supervisor: doc. Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry