Vývoj metody stanovení relativní exprese genů CD9 a CD81 kódujících tetraspaninové proteiny ve varleti a nadvarleti koně domácího s využitím termocykleru LightCycler® Nano (Roche)

Bc. Anna Bílková

Master's thesis

Development of a method for determining the relative expression of CD9 and CD81 genes encoding tetraspanin proteins in the testis and epididymis of a domestic horse using the LightCycler® Nano (Roche) thermocycler

Abstract:

Tato diplomová práce se zabývala metodikou stanovení relativní exprese genů CD9 a CD81 ve varleti a nadvarleti koně domácího. Tyto geny kódují tetraspaninové proteiny, které jsou exprimovány v různých tkáních živočišných organismů. CD9 a CD81 jsou transmembránové proteiny s řadou funkcí, ať už jde o funkce fyziologické, tak i patologické. Analýza exprese genů CD9 a CD81 byla provedena u vzorků pěti jedinců koně domácího, které byly odebrány veterinárním lékařem ve dvou biologických replikátech. Studována byla exprese genů v tkáni testes a ve všech morfologických částech epididymis, tedy caput, corpus a cauda epididymis. Z tkání byla izolovaná RNA pomocí metody vazebných kolonek, které na sebe naváží RNA z lyzátu. Izolovaná RNA byla zmražena v kapalném dusíku a skladována při teplotě -80℃. Izolace RNA touto metodou proběhla bez obtíží. Výsledná RNA neměla tendence degradovat a neobsahovala kontaminanty. Bylo navrženo pět párů primerů pro každý CD gen (F1/R1 až F5/R5) a jeden pár primerů pro house keepingový gen β-aktin. Tyto primery byly testovány, dle stanovených požadavků. Byla hodnocena specifičnost amplifikace pomocí elektroforetického testu, sekvenace amplikonů, byla stanovena teplota tání produktu qRT-PCR a hodnota eficience CD genů a house keepingového genu. Pro gen CD9 byl použit primerový pár F4/R4 a pro gen CD81 primerový pár F2/R2, jelikož nejlépe splňovaly dané požadavky. Cílem práce bylo zjistit, který z faktorů (gen, typ tkáň, jedinec, biologický replikát) má vliv na expresi daných CD genů. Vyhodnocení bylo provedeno metodou stanovení relativní exprese genů CD9 a CD81 pomocí qRT-PCR. Ke statistickému vyhodnocení byla stanovena hodnota Ratio ΔCq, která byla vztažena k house keepingovému genu β-aktin (ACTB). Z výsledků práce vyplývá, že faktor, který ovlivňuje míru exprese je tkáň a gen. Gen CD81 se více exprimoval v testes a gen CD9 se exprimoval více v epididymis koně domácího. Oba geny se nejméně exprimovaly v cauda epididymis. Srovnání s výsledky dalších autorů je složité. Řada autorů se soustředí na detekci proteinů na spermii, a nikoliv na expresi genů CD ve varlatech a nadvarletech, přesto, že jsou spermie transkripčně neaktivní. Dalším problémem je fakt, že studie exprese CD9 a CD81 u koně domácího nebyla dosud publikována. Nicméně, přes značnou variabilitu napříč modelovými druhy, výsledky odpovídají studiím, které tyto proteiny detekovaly na spermiích ve varleti a nadvarleti. V průběhu toho dvouletého výzkumu databáze Ensembl publikovala informace o třech transkripčních variantách genu CD81. Na základě těchto informací doporučuji vývoj dalších expresních markrů, které odliší tyto tři transkripční varianty a budou tedy navrženy do exonů, kterými se tyto tři transkripční varianty liší. Řešení diplomové práce bylo podpořeno projekty GA FAPPZ Studium geneticky podmíněných vlastností s využitím molekulárně-genetických, bioinformatických a statistických metod (SV20-9-21360), Molekulární analýza nukleových kyselin rostlin a živočichů a možnosti jejího hodnocení s využitím metod bioinformatiky a biostatistiky (SV19-07-21360) a projektu CIGA Zlepšení mrazitelnosti hřebčích spermií přidáním proteinů semenné plazmy do kryokonzervačního média (2018200).

Abstract:

This diploma thesis dealt with the methodology of determining the relative expression of CD9 and CD81 genes in the testis and epididymis of a domestic horse. These genes encode tetraspanin proteins that are expressed in various tissues of animal organisms. CD9 and CD81 are transmembrane proteins with a number of functions, both physiological and pathological. Analysis of CD9 and CD81 gene expression was performed on samples from five domestic horses that were collected by a veterinarian in two biological replicates. The expression of genes in the tissue tested on all morphological parts of the epididymis, ie caput, corpus and cauda epididymis, was studied RNA was isolated from the tissues using binding columns, which bind RNA from the lysate. Isolated RNA was frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ℃. RNA isolation was performed without any difficulties. Isolated RNA did not tend to degrade and contained no contaminants. Five primer pairs were designed for each CD gene (F1/R1 to F5/R5) and one primer pair for the housekeeping gene β-actin. These primers have been tested in complience with set requirements. The specificity of the amplification was evaluated by means of an electrophoretic assay, sequencing of the amplicons, the melting temperature of the qRT-PCR product and the efficiency value of the CD genes and the housekeeping gene were determined. The F4/R4 primer pair was used for the CD9 gene and the F2/R2 primer pair for the CD81 gene, as they met the requirements accordingly. The goal of this study was to find out, which of the factors (gene, tissue type, individual, biological replicate) affects the expression of given CD genes. Evaluation was conducted by determining the relative expression of the CD9 and CD81 genes by qRT-PCR. For statistical evaluation, the Ratio ΔCq value was determined with regard to the β-actin housekeeping gene (ACTB). From the results, it can be concluded that the factors affecting the level of gene expression are tissue and gene. The CD81 gene was expressed more in the testes and CD9 gene was expressed more in the epididymis of the domestic horse. The lowest level of expression for both genes was measured in the cauda epididymis. Comparison with results from other authors is difficult. Many authors focus on the detection of proteins in sperm membrane, not on the expression of CD genes in testes and epididymis, even though sperm cells are transcriptionally inactive. Another issue is that there have been no publications about the expression of CD9 and CD81 in the domestic horse so far. Nevertheless, despite considerable variability across model species, our results are in agreement with the results from published research, that detected these proteins in sperm in the testis and epididymis. During this two-year study, the Ensembl database published information on three transcriptional variants of CD81. Based on this information, I recommend the development of more expression markers, which differentiate these three transcriptional variants and will therefore be designed into specific exons, which are different in each variant. The solution of the diploma thesis was supported by projects GA FAPPZ Study of genetics conditions using molecular genetic, bioinformatics and statistical methods (SV20-921360), Molecular analysis of nucleic acids of plants and animals and the possibility of its evaluation using methods of bioinformatics and biostatistics (SV19-07-21360) and project CIGA Improving the freezability of stallion sperm by adding seminal plasma proteins to the cryopreservation medium (2018200).

Keywords

kůň domácí, Equus caballus, geny CD9 a CD81, tetraspaniny, exprese, qRTPCR, sekvenace

Keywords

domestic horse, Equus caballus, CD9 and CD81 genes, tetraspanins, expression, qRT-PCR, sequencing

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl
• Reader: Filipa Bubeníčková, Ing.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology