Genotoxické a negenotoxické efekty derivátů polycyklických aromatických uhlovodíků

Bc. Lenka Dostálová, Ph.D.

Master's thesis

Abstract:

Diplomová práce je zaměřena na studium genotoxických a negenotoxických účinků methylovaných PAHs, které jsou významnými kontaminanty životního prostředí a jejichž mechanismy účinků nejsou dosud dobře prozkoumány. Cílem této práce bylo charakterizovat některé klíčové mechanismy methylovaných PAHs v modelových jaterních buněčných liniích. Methylované deriváty PAHs mohou působit genotoxickými a negenotoxickými mechanismy spojenými s nádorovou promocí. Aktivace receptoru AhR (aryl hydrocarbon receptor) vede nejen k indukci enzymů metabolické aktivace PAHs jako jsou cytochromy P450 podrodiny 1A a 1B, ale také k AhR-depedendentnímu uvolnění buněk z kontaktní inhibice. Aktivace AhR byla sledována pomocí metody DR-CALUX (Chemical-activated luciferase expression assay) v jaterní hepatoma linii H4IIE.Gud.Luc stabilně transfekované luciferasovým reportérovým genem. Inhibice mezibuněčné komunikace (GJIC) byla stanovena mikroskopicky metodou scrape loading/dye transfer v jaterních epiteliálních WB-F344 buňkách potkana. Genotoxické efekty methylovaných PAHs byly sledovány jako aktivace (fosforylace) a akumulace proteinu p53 v linii WB-F344 metodou Western blotting. Metabolickou aktivací PAHs jsou produkovány oxidované deriváty PAHs, např. katecholy a chinony, které mohou být významnými induktory oxidativního stresu. Byla zavedena metoda stanovení produkce ROS průtokovou cytometrií za použití fluorescenčních sond DCFH-DA (dichlorodihydrofluorescein diacetát) a DHR 123 (dihydrorhodamin 123).

Abstract:

This thesis is make for studium of genotoxic and nongenotoxic effects of methylate PAHs. The mechanisms this class environmental contaminants aren't still inspect. The principal goal of this thesis was a characterization of some key mechanisms of action of methylbenz[a]anthracenes in model rat liver cells. Methylated derivatives of PAHs can also cause nongenotoxic effects connected with tumor promotion. Activation of AhR (aryl hydrocarbon receptor) leads not only to induction of enzymes CYP4501A and 1B1, but it also induces an AhR-dependent release of cells from contact inhibition. Activation of AhR was monitored by DR-CALUX (Chemical-Activated LUciferase eXpression assay) in rat hepatoma H4IIE.Gud.Luc cells, stably transfected with a luciferase reporter gene. Inhibition of gap junction intercellular communication (GJIC) was determined by scrape loading/dye transfer method in rat liver epithelial cells WB-F344. Genotoxic effects of methylated benz[a]anthracenes were determined as phosphorylation of p53 in WB-F344 by Western blotting. Metabolic activation of PAHs may produce oxidized derivatives of PAHs, e.g. catechols and quiones, which can represent significant inductors of oxidative stress. In this work, a flow cytometric method of determination production ROS was introduced and production of ROS was detected in WB-F344 cells. These cells were exposed to model inductors of ROS and selected methylate benz[a]anthracenes.

Keywords

polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs), methylované benz[a]anthraceny, aryl hydrocarbon receptor (AhR), gap junction intercellular communication (GJIC), reaktivní kyslíkové radikály (ROS) genotoxické mechanismy, negenotoxické mechanismy, p53

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 6. 2006

Thesis defence

• Date of defence: 23. 5. 2006
• Supervisor: RNDr. Miroslav Machala, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry