Sodno-draselná ATPasa - exprese, purifikace a její interakce s malýi molekulami

Mgr. Jaroslava ŠEFLOVÁ

Disertační práce

The preparation of the Na+/K+-ATPase mutants and their study using methods of fluorescence spectroscopy

Abstract:

The Na+/K+-ATPase (NKA) is an essential membrane protein establishing electrochemical gradient used in cell processes. Dysfunction of NKA leads to pathological states and diseases. This thesis is focused on the relations between structure and function using available experimental approaches. Whole protein was prepared by two methods - direct isolation from porcine kidney and by heterologous expression in yeast. NKA isolated from porcine kidney was used for testing of biologically active molecules such as potential drugs (flavonolignans, halogenated hydroquinolones and platinum-based complexes). Furthermore, we studied the interactions of promising molecules inhibiting NKA activity using the modified Baginsky assay. Isolated cytoplasmic parts of the enzyme, represented by C23 and C45 loops, were used for determination of their binding site and for study of inhibitory mechanism.

Abstract:

Dizertační práce se zaměřuje na studium významného membránového proteinu, sodno-draselné pumpy. Tento enzym svou funkcí vytváří elektrochemický gradient, který je významný pro celou řadu buněčných procesů. V případě nesprávné funkce sodno-draselné ATPasy dochází ke vzniku patologických stavů, poruch a nemocí. Cílem této práce bylo studovat souvislosti mezi strukturou a funkcí toho proteinu s využitím dostupných experimentálních postupů. Příprava celé sodno-draselné pumpy byla provedena dvěma metodami - přímou izolací z tkáně a heterologní expresí v kvasinkách. Enzym izolovaný z prasečích ledvin byl použit pro zkoumání inhibice sodno-draselné pumpy po interakci s flavonolignany, halogenovanými chinolony a platinovými cytostatiky. Změna aktivity enzymu byla detekována pomocí modifikované Baginského metody, která určuje koncentraci fosfátu z hydrolýzy ATP. Dále byly heterologní expresí v bakteriích připraveny izolované cytoplasmatické segmenty proteinu (C45 a C23 kličky). Tyto kličky umožňují zkoumat interakci sodno-draselné pumpy a biologicky významných látek rozpustných ve vodných pufrech. Vybrané aktivní látky byly cílem dalšího výzkumu zaměřeného na odhalení vazebného místa a mechanismu inhibice enzymu.

Keywords

sodno-draselná ATPasa, exprese v bakteriích, exprese v kvasinkách, C45 klička, C23 klička, Baginského metoda určení ATPasové aktivity, flavonolignany, halogenované chinolony, cisplatina

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 9. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. RNDr. Martin Kubala, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika