Přípravné kroky pro imunomagnetickou separaci cirkulujících nádorových buněk

Mgr. Eva Novotná

Master's thesis

First steps in development of immunomagnetic carrier for efficient separation of circulating tumor cells

Anotácia:

Detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi pacientů je důležitá nejen pro včasné odhalení nádorového bujení, ale hlavně pro sledování průběhu a úspěšnosti protinádorové terapie. Tato diplomová práce vznikla jako součást projektu zabývajícího se vývojem nového mikroprůtokového zařízení pro izolaci těchto buněk. Izolace cílových buněk je zprostředkována magnetickými částicemi s navázanými specifickými protilátkami proti povrchovým strukturám specifickým pro cirkulující nádorové buňky. Cílem naší práce byl výběr vhodných magnetických částic pro imobilizaci protilátek, optimalizace jejich vazby a provedení přípravných kroků pro separaci buněk. Jako modelové protilátky byly používány lidské IgG, které jsme nejprve imobilizovali na magnetické částice s různými funkčními skupinami. Vazba IgG na tyto částice byla jak orientovaná, tak neorientovaná. Účinnost vazby IgG jsme kvantifikovali pomocí několika analytických a imunoanalytických metod. Poté jsme se zaměřili na orientovanou vazbu protilátek na komerční a nově syntetizované magnetické částice, porovnávali účinnost vazby u obou typů částic a optimalizovali podmínky této vazby. Výsledky optimalizací budou dále využity u nově syntetizovaných částic s hydrazidovou funkční skupinou (-CO-NH-NH2), které budou svými parametry vyhovovat pro mikroprůtokové systémy. Posledním úkolem naší práce bylo vyzkoušet imunomagnetickou separaci buněk pomocí komerčních částic s imobilizovanými specifickými protilátkami. Jako modelový systém pro separaci eukaryontních krevních buněk jsme nejprve zvolili bakteriální buňky, separovali je podle doporučeného postupu a poté některé kroky optimalizovali pro naše podmínky a vyhodnotili procentuální účinnost optimalizovaných separací. Nakonec jsme provedli separaci lidských buněk z plné krve.

Abstract:

Detection of circulating tumor cells (CTCs) in the blood of patients is important not only for the early detection of tumor growth but mainly for monitoring of the progress and success of anticancer therapy. This thesis was created as a part of project dealing with the development of a new microfluidic device for isolation of these cells. Isolation of target cells is mediated by magnetic particles with immobilized specific antibodies against surface structures specific for CTCs. The aim of our study was to select suitable magnetic particles for antibody immobilisation, optimisation of binding efficiency and select the carriers suitable for immunomagnetic separation. As a model antibody human IgG molecules were used. We immobilized them on the surface of magnetic particles with different functional groups, so the IgG molecules were either randomly without site-specific orientation or orientedly with steric accessible both binding sites. Binding efficiency of IgG was quantified by several analytical and immunoanalytical methods. Then we performed site-specific immobilization of IgG molecules to the commercial and newly synthesized magnetic particles, we optimized reaction conditions and compared the effectiveness of the binding. Results will be applied to preparation of CTC-specific immunosorbent based on newly-synthesized particles with hydrazide functional groups (-CO-NH-NH2), whose parametres are suitable for use in microfluidic device. The final task of our study was to test the immunomagnetic cell separation using commercial particles with specific antibodies immobilized on their surface. As a model system we initially chose the bacterial cells, separated them according to the recommended procedure and then we optimized some steps for our conditions and evaluated the percentage efficiency. Finally, we performed the separation of human cells from whole blood.

Kľúčové slová

cirkulující, nádorové, buňky, magnetické, částice, protilátky, IgG, imunomagnetická, separace, buněk

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 6. 2010
• Vedúci: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / odbor:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials