Functional Analysis of Mutants Affected in Regulation of Intracellular Trafficking and Adaptation to Osmotic Stress

Mgr. Vendula Pukyšová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Jako sesilní organismy jsou rostliny neustále vystavovány nepříznivým podmínkám prostředí a stresovým faktorům. Mají však k dispozici několik unikátních mechanismů, které jim umožňují rychle reagovat na exogenní změny. Jeden ze způsobů adaptace nastává na úrovni nitobuněčného transportu, který je třeba neustále přizpůsobovat měnícím se podmínkám za účelem zachování buněčné homeostázy a integrity membrán. Pro vytvoření transportního váčku je třeba membránu deformovat, což je zajištěno prostřednictvím vícero faktorů, včetně aktivity specifických membránových proteinů. Mezi takovéto proteiny se řadí i flipázy z rodiny P4-ATPáz, které umožňují přesmyk fosfolipidů z vnějšího / luminálního listu lipidové dvouvrstvy do vnitřního. To může být spojeno s vazbou proteinů zapojených do tvorby transportních váčků na specifická místa donorových membrán. V této práci dokládáme, že ztráta funkce AMINOPHOSPHOLIPID ATPázy3 (ALA3) flipázy způsobila defekty v plazmatické membráně a trans-Golgi síti, které vyústily v aberantní endocytózu a sekreci – procesy související s tvorbou a pohybem vezikul. Tyto nitrobuněčné aberace se navíc projevily sníženou flexibilitou transportu váčků, která zapříčinila zhoršenou schopnost semenáčků upravit růst hlavního kořene na médiu vyvolávajícím osmotický stres. Dále ukazujeme, že ALA3 spolupracuje s ARF1A1C/BEX1 a ARF-GEF BIG5/BEN1 v podobné dráze regulující tvorbu vezikul, a společně jsou důležité pro adaptaci rostlin na osmotický stres. Dodatečně jsme podrobili výzkumu čtyři LAVA mutanty, kteří byli objeveni v genetickém screeningu semenáčků s abnormálním vývojem laterálních kořenů při pěstování na médiu obsahujícím auxin. Naše předběžná data mají za cíl přemostit poruchy nitrobuněčného transportu a zhoršenou reakci na osmotický stres, které u mutantů pozorujeme, s vývojovými procesy doprovázejícími zakládání laterálních kořenů.

Abstract:

As sessile organisms, plants are constantly exposed to unfavorable environmental conditions. However, they developed several unique mechanisms enabling them to rapidly respond to exogenous changes. One of the mechanisms of adaptation occurs at the level of early subcellular trafficking, which needs to be rapidly adjusted to maintain the cellular homeostasis and membrane integrity under osmotic stress conditions. To form a vesicle, the membrane needs to be deformed, which is ensured by multiple factors, including the activity of specific membrane proteins. Such proteins encompass flippases from the family of P4-ATPases, which actively translocate phospholipids from the exoplasmic/luminal to the cytoplasmic membrane leaflet to generate curvature. This might be coupled with recruitment of proteins involved in transport vesicle formation at specific sites of the donor membranes. We show that lack of the AMINOPHOSPHOLIPID ATPase3 (ALA3) flippase function caused defects at the plasma membrane and trans-Golgi network, resulting in altered endocytosis and secretion, processes relaying on vesicle formation and movement. These cellular defects were translated into decreased intracellular trafficking flexibility failing to adjust the root growth on osmotic stress eliciting media. Moreover, we show that ALA3 cooperates with ARF1A1C/BEX1 and ARF-GEF BIG5/BEN1 in a similar regulatory pathway of vesicle formation and together they are important for plant adaptation to osmotic stress. Additionally, we provide a characterization of four LAVA mutants that were obtained from a forward genetic screen for candidates defective in lateral root development when grown on auxin. Our preliminary data aim to bridge the subcellular trafficking defects observed in the mutants, as well as their impaired response to osmotic stress, with the developmental events that occur during LR development.

Keywords

Arabidopsis thaliana, ARF, endocytóza, flipáza, GEF, mannitol, nitrobuněčný transport, osmotický stres, PIN proteiny, sekrece, transportní vezikuly, endocytosis, flippase, osmotic stress, PIN proteins, secretion, intracellular trafficking, transport vesicles

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 7. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 26. 10. 2023
• Supervisor: B.A. Marta Zwiewka, M.Sc.
• Reader: Mgr. Kamil Růžička, Dr. rer. nat., Tamara Pečenková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics