Charakterizace fosfoproteomu nádorových buněčných linií

Bc. Damián Lipták

Bakalářská práce

Phosphoproteome characterization of cancer cell lines

Anotace:

Karcinom renálních buněk (RCC) je nejrozšířenějším typem nádoru ledvin s vysokou incidencí v České republice a na Slovensku. V současnosti se uplatňují především cílené typy léčby, která moduluje signalizační dráhy a imunitní odpověď. Sunitinib, účinný inhibitor tyrosinkinas, efektivně reguluje angiogenezi a hypoxii u RCC tumorů cílením na receptory VEGF a PDGF. Studium fosfoproteomu se proto nabízí jako vhodný nástroj pro pochopení mechanismů rozvoje RCC. V bakalářské práci jsme využili kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) k porovnání (i) výstupů s využitím datově závislé (DDA) a datově nezávislé (DIA) akvizice dat pro studium fosfoproteomu buněčných linií, (ii) dvou metod obohacení fosfopeptidů založených na Fe-NTA a TiO2, a (iii) fosforylace buněčných linií 786-0 a Caki-1 v odpovědi na působení sunitinibu. Celkem bylo v režimu DIA identifikováno o 57 % větší pokrytí fosfopeptidů než v režimu DDA. V rámci DIA bylo ve vzorcích obohacených Fe-NTA identifikováno o 10 % víc fosfopeptidů, než u obohacení TiO2 u obou buněčných liniích. Počet fosfopeptidů identifikovaných výhradně u obohacení Fe-NTA byl pětinásobně větší oproti počtu fosfopeptidů identifikovaných výhradně u obohacení TiO2. Počet peptidů fosforylovaných na tyrosinu byl mezi metodami obohacení srovnatelný, u Fe-NTA bylo identifikováno pouze o 2.5 % víc než u TiO2. Analýza DIA dat ukázala, že sunitinib snižuje fosforylaci klíčových substrátů kináz zapojených do signalizační dráhy VEGF, jako jsou MAPK14, MAPK1, PTK2 (FAK) a AKT1, a naopak zvyšuje fosforylaci kináz jako je PTK2 (FAK) a zvyšuje abundanci AXL. Výsledky práce poskytují srovnání různých metodických přístupů pro analýzu fosfoproteomu a poukazují na fosfopeptidy a fosfoproteiny, jejichž fosforylační status byl ovlivněn působením sunitinibu u dvou buněčných linií odvozených od RCC.

Abstract:

Renal cell carcinoma (RCC) is the most prevalent type of kidney cancer, with high incidence rates in the Czech Republic and Slovakia. Current treatments primarily involve targeted therapies that modulate signaling pathways and the immune response. Sunitinib, a potent tyrosine kinase inhibitor, targets the VEGF and PDGF receptors to regulate angiogenesis and hypoxia in RCC tumors. Thus, phosphoproteome study emerges as a suitable tool for understanding the RCC development mechanisms. In the bachelor thesis, we utilized liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to compare (i) outputs using data-dependent (DDA) and data-independent (DIA) data acquisition for the study of the phosphoproteome of cell lines, (ii) two phosphopeptide enrichment methods based on Fe-NTA and TiO2, and (iii) phosphorylation of the 786-0 and Caki-1 cell lines in response to sunitinib treatment. In total, there was a 57 % higher coverage of phoshpopeptides identified in DIA mode compared to DDA mode. Within DIA mode, 10 % more phosphopeptides were identified in samples enriched by Fe-NTA than in the samples enriched by TiO2. The phosphopep-tides exclusively identified within Fe-NTA enrichment were fivefold higher than those exclusively identified in TiO2 enrichment. The number of tyrosine-phosphorylated peptides was comparable between enrichment methods, with only 2.5 % more phosphopeptides identified in Fe-NTA than in TiO2-enriched samples. Analysis of DIA data indicated decreased phosphorylations of key substrates of kinases involved in the VEGF signaling pathway, such as MAPK14, MAPK1, PTK2 (FAK), and AKT1. Simultaneously, an increased phosphorylation of kinases like PTK2 (FAK), and an increased abundance of AXL was observed. This thesis compares various methodological approaches for phosphoproteome analysis and highlights phosphopeptides and phosphoproteins whose phosphorylation status was affected by sunitinib treatment in two RCC-derived cell lines.

Keywords

Renal cell carcinoma, VEGF pathway, sunitinib, phosphoproteomics, Fe-NTA enrichment, TiO2 enrichment, LC-MS/MS

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 26. 6. 2024
• Vedoucí: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Karolína Kryštofová

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Aplikovaná biochemie