Úloha S-nitrosoglutathionreduktasy ve vývoji a obranné reakci rajčete Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom

Bc. Zuzana ŽVÁTOROVÁ

Master's thesis

Role of S-nitrosoglutathione reductase in development and defence responses of tomato Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom

Abstract:

Diplomová práce byla zaměřena na posttranslační modifikace proteinových cysteinů reaktivními formami kyslíku a dusíku. Mezi nejdůležitější modifikace patří S-nitrosylace, která produkuje S-nitrosothioly, látky sloužící jako zásobní nebo transportní formy oxidu dusnatého (NO) in vivo. Na kontrole hladiny S-nitrosothiolů se podílí řada enzymů, jako je thioredoxin, protein-disulfidisomerasa, karbonylreduktasa, a další. Za klíčový enzym je považována i S-nitrosoglutathionreduktasa, která se nepřímo podílí na regulaci posttranslačních modifikací proteinů pomocí S-nitrosylace. V závěru teoretické části práce jsou také shrnuty poznatky o rajčeti Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom a jeho odolnosti na biotické a abiotické stresové podmínky. Experimentální část byla zaměřena na charakterizace posttranslační regulace aktivit rostlinných GSNOR in vitro a na studium enzymu GSNOR během vývoje rajčete Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom a reakce rostlin na stresové podmínky. Pro práci in vitro byly připraveny rekombinantní proteiny SlGSNOR, AtGSNOR a jeho tři mutanti, C284S, C271S, C10S. Všechny byly exprimovány v E. coli jako N-terminální proteiny nesoucí 6xHis-Tag a purifikovány metodou chelatační chromatografie. Byly stanoveny základní kinetické parametry purifikovaných proteinů a sledován vliv mutací cysteinových zbytků na specifickou aktivitu enzymu a jeho inhibici působením H2O2 a donorů NO. Během vývoje rostlin Micro-Tom byla stanovena aktivita i hladina relativní exprese pomocí RT-PCR. Nejvyšší exprese GSNOR byla pozorována u stonků a květů, zatímco nejvyšší aktivita u stonků a zelených plodů. Analýza metodou biotinového switche prokázala významné rozdíly v hladině S-nitrosylovaných proteinů u mutanta nahG. Během působení teplotního stresu na Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom došlo k poklesu aktivity, k nárůstu hladiny exprese, která se výrazně snížila po 24 hod. U mutantní rostliny Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom nahG došlo také k poklesu aktivity během působení teplotního stresu, výraznější pokles exprese u něj nastal také ve 24 hod. Během teplotního stresu došlo k významným změnám parametrů glutathionového redoxního systému.

Abstract:

The thesis was focused on posttranslational modifications of protein cysteines by reactive oxygen and nitrogen species. Among the most important modifications belongs the S-nitrosylation, which produces S-nitrosothiols. S-nitrosothiols are used as storage or transport forms of nitric oxide (NO) in vivo. A number of enzymes is involved in the control of levels of S-nitrosothiols (thioredoxine, protein disulfide isomerase, carbonyle reductase, and others). The key enzyme is considered to be S-nitrosoglutathione reductase, which is indirectly involved in the regulation of post-translational modifications of proteins via S-nitrosylation. There is a summarized knowledge of tomato Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and his resistance to biotic and abiotic stress conditions included at the end of the theoretical work. The experimental part was focused on the characterization of post-translational regulation of the activity of plant GSNOR in vitro and on the study of the enzyme GSNOR during the development of tomato Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and the responses of plants to stress conditions. Recombinant proteins SlGSNOR, AtGSNOR and its three mutants, C284S, C271S, and C10S were prepared for studies in vitro. All of them were expressed in E. coli as N-terminal protein carrying a 6xHis-Tag and proteins were purified by the method of chelating chromatography.. Basic kinetic parameters of the purified protein were determined and effects of mutations of selected cysteine residues to a specific activity of the enzyme and its inhibitory by H2O2 and donors NO were monitored. The activity and the level of relative expression of GSNOR were determined during the development of Micro-Tom plants. The level of relative expression was measured by RT-PCR. The highest expression of GSNOR was observed in stems and flowers, while the highest activity was at the stems and green berries. Analysis by the biotin switch method demonstrated significant differences in the level of S-nitrosylated proteins in the mutant nahG. During the action of temperature stress on Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom plants the activity of GSNOR was reduced. The level of expression increased, but after 24 hours significantly decreased. Activity also decreased in mutant plants of Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom nahG during exposure to heat stress. Significant changes were not seen in the level of expression, but pronounced reduction was observed after 24 hours. During heat stress significant changes were measured of the parameters of the glutathione redox system.

Keywords

S-nitrosoglutathionreduktasa, S-nitrosylace, Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom, teplotní stres

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 4. 2016

Accessible from:: 22. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry