Kvadruplexy v lidském genomu

Mgr. Zuzana Dvořáková, Ph.D.

Doctoral thesis

Quadruplexes in human genome

Abstract:

ABSTRAKT DNA v buňkách je neustále vystavována působení endogenních a exogenních faktorů, jako např. UV záření, ionizačnímu záření a působení reaktivních sloučenin, což může vést k jejímu poškození. Neopravené mutace v nukleových kyselinách představují mutagenní a prokarcinogenní riziko pro organismus. Mnoho pozornosti bylo věnováno různým poškozením vznikajícím na dvouřetězcové DNA, ale co se týče nekanonických struktur, G kvadruplexů (G4) a i-motivů (iM), je této problematice věnována pozornost až v poslední době. Čtyřřetězcová uspořádání vznikají ve funkčně důležitých oblastech genomu, jako jsou promotorové oblasti genů a telomery. Předložená disertační práce je věnována zkoumání vlivu přirozeně se vyskytujících poškození na tvorbu a stabilitu čtyřřetězcových struktur lidské telomerní sekvence. Na krátkých úsecích, obsahujících pět nebo šest guaninových bloků (G-bloků), bylo zkoumáno, jak se DNA dokáže vyrovnat s poškozeným G-blokem při tvorbě G4. Pro tuto studii bylo vybráno narušení pravidelné sekvence náhradou prostředního guaninu v bloku tří guaninů abazickým (AP) místem. V případě, že byl substituován krajní G-blok (na 5´, nebo na 3´konci molekuly), vznikal G4 v posunutí o příslušné guaninové opakování a narušený G-blok byl vynechán z tvorby G4. Poškozený vnitřní G-blok byl vysunut do smyček. Typ vytvořeného kvadruplexu závisel na poloze poškozeného místa v molekule a na prostředí experimentu. V následující části práce byl poprvé zkoumán strukturní efekt vícenásobného (kumulovaného) poškození na tvorbu G4, kdy byly AP místem nahrazeny buď guaniny v tetrádách, nebo adeniny ve smyčkách, nebo obě báze současně. AP místa ve smyčkách způsobovala nárůst populace paralelních řetězců díky stabilizaci „vrtulové“ smyčky vně těla kvadruplexu a posunutí strukturní rovnováhy od antiparalelního k hybridnímu nebo paralelnímu uspořádání. Kombinace AP místa ve smyčce i v guaninovém jádře destabilizovala strukturu, přičemž ale AP místo ve smyčce dokázalo v některých kombinacích účinek narušené G-tetrády zmírnit. Značná část práce byla věnována porovnávání vlivu různých typů poškození na tvorbu a stabilitu G4 i iM. Srovnávali jsme účinky AP místa, 8 oxoadeninu (8oxoA) a 5 hydroxymethyluracilu (5hmU), nejčastěji se vyskytujících poškození DNA, umístěných ve smyčkách. Největší změny způsobovalo AP místo, strukturu však ovlivňovalo spíše umístění poškození než jeho typ. V poslední části práce byl studován vliv náhrady cytosinů v cytosinovém jádře iM telomerní sekvence uracilem. Tato báze vzniká spontánně deaminací cytosinu a zabraňuje tvorbě C∙C+ páru, tedy základní stavební jednotky iM. Náhrada cytosinu za uracil posouvala tvorbu iM směrem do kyselejšího prostředí a výrazně snižovala jeho stabilitu. Efekt uracilu se odvíjel od jeho umístění v rámci sekvence. Získané výsledky nám umožnily formulovat jednoduchá pravidla pro tvorbu iM.

Abstract:

ABSTRACT DNA in cells is continuously exposed to endogenous and exogenous processes like e.g. UV radiation, ionizing radiation and the action of reactive compounds, which can lead to its damage. Unrepaired mutations in nucleic acids represent mutagenic and procarcinogenic risk for organism. While much attention has been paid to various damage arising in double-stranded DNA, non-canonical structures, G-quadruplexes (G4) and i-motifs (iM), have been examined only recently. Four-stranded arrangements arise in functionally important regions of the genome, like in promoter regions of genes and telomeres. This doctoral thesis is focused on examination of how naturally occurring lesions influence formation and stability of four stranded-structures of the human telomere sequence. We have studied how short regions containing five or six guanine blocks (G-blocks) cope with a damaged G-block during G4 formation. For this study, we chose the modifications of regular sequence, where the middle guanine in the G-block of three guanines was replaced by an abasic (AP) site. In case that the outer G-block (at the 5´or 3´end of molecule) was substituted, G4 was formed in a shift about corresponding guanine repeat. The damaged inner G-block was pushed out to loops. The type of formed G4 depended on the location of damage in a molecule and on experimental conditions. In the next part of this doctoral thesis, the structural effect of clustered damage on G4 forming was examined. Guanines in tetrads or adenines in loops or both simultaneously were replaced by the AP site. The AP site in a loop caused an increase in parallel strand population via stabilization of a propeller loop set aside the G4 body and an equilibrium shift from antiparallel to hybrid or parallel arrangements. The simultaneous presence of AP sites in loops and in the guanine core destabilized the structure but at the same time some combination of AP sites in loops managed to moderate the impact of disturbed G-tetrads. A substantial part of the doctoral thesis is dedicated to comparing the influence of various lesions on G4 and iM forming and stability. We have confronted the effects of AP site, 8-oxoadenine (8oxoA) and 5-hydroxymethyluracil (5hmU), which are the most common DNA lesions, located in loops. The AP site caused the biggest changes, but on the whole, the structure was more influenced by the location of lesions rather than by their type. The last part of the doctoral thesis dealt with the influence of substitution of cytosine in the cytosine core of telomere iM with uracil. This modification arises spontaneously as a result of cytosine deamination and hinders the formation of C∙C+ base pair, which is a fundamental unit of iM. This lesion shifted the formation of iM towards more acidic conditions and decreased strongly its stability. The effect of uracil depended on its locations in sequence. The obtained results enabled us to formulate simple rules for iM formation.

Keywords

Čtyřřetězcové struktury DNA, Guaninový kvadruplex, Cytosinový i-motiv, Poškození bází, CD spektroskopie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 25. 6. 2018
• Supervisor: prof. RNDr. Michaela Vorlíčková, DrSc.
• Reader: doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D., prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry