Optimalizace podmínek vazby kináz GSK-3 a MAPK na superparamagnetické částice

Mgr. Martina Panýrová

Diplomová práce

Optimization of GSK-3 and MAP kinases immobilization to superparamagnetic particles

Anotace:

V diplomové práce byly provedeny optimalizace podmínek fosforylace substrátu CREB fosfopeptidu (cAMP Response Element Binding Protein) enzymem GSK-3 a substrátu TH 24 - 33 (Tyrosine hydroxylase 24 - 33) enzymem MAPK- His tag a optimalizace podmínek imobilizace obou enzymů na superparamagnetické částice. Mezi sledované parametry patřily teplota a délka fosforylace. GSK-3 byla imobilizována na magnetické nosiče SiMAG-IDA/Nickel, SiMAG-PGL, SiMAG-IDA/Co3+ a BcMAG Aldehyde magnetické částice. MAPK- His tag byla úspěšně imobilizována na SiMAG-IDA/Co3+ a BcMAG Aldehyde magnetické částice. U všech nosičů pro GSK-3 byla sledována skladovací stabilita, u některých případně operační stabilita. Nejstabilnější byla imobilizace GSK-3 na SiMAG-IDA/Co3+ sledovaná po jednom týdnu. GSK-3 i MAPK-His tag byly pouţity pro přípravu tzv. hyperfosforylovaného tau proteinu, jako standardu. Tau protein byl štěpen imobilizovaným trypsinem. Fosforylace peptidových substrátů byly potvrzeny pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Následnou analýzou MALDI TOF/TOF se potvrdila fosforylace u tau peptidu 45 - 67 s Mr 2471 Da.

Abstract:

In this diploma thesis there were optimized conditions of phosphorylation for substrates CREB phosphopeptide by enzyme GSK-3 and for TH 24 - 33 by enzyme MAPK-His tag, and further optimization of conditions for GSK-3 and MAPK immobilization on different superparamagnetic particles. Two parameters were tested, temperature and time of phosphorylation. For immobilization of GSK-3 these superparamagnetic particles were applied: SiMAG-IDA/Nickel, SiMAG-PGL, SiMAG-IDA/Co3+ and BcMAG Aldehyde. MAPK-His tag was successfully immobilized on SiMAG-IDA/Co3+ and BcMAG Aldehyde superparamagnetic particles. Storage and operational stability of each immobilized GSK-3 reactors were monitored. The most stable immobilized GSK-3 reactor was prepared on SiMAG-IDA/Co3+. GSK-3 and MAPK-His tag were applied for preparing so-called hyperphosphorylated tau protein, which occurs in patients with Alzheimer´s disease. Phosphorylation of peptide substrates and tau proteins were detected by MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.

Klíčová slova

Alzheimerova nemoc, tau protein, GSK-3, MAPK, fosforylace, imobilizace kináz

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 1. 6. 2010
• Vedoucí: Mgr. Marcela Slováková, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů