Molekulární struktura polyvalentního stafylokokového bakteriofága

Mgr. Luděk Eyer, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular structure of the polyvalent staphylococcal bacteriophage

Anotácia:

Virulentní a polyvalentní fág 812 z čeledi Myoviridae vykazuje velmi široké rozmezí hostitele v rámci rodu Staphylococcus. Genom fága 812 je tvořen lineární dsDNA o velikosti cca 145 kbp a vykazuje podobnou modulární organizaci a vysoký stupeň sekvenční homologie s genomy příbuzných stafylokokových fágů K, G1, Twort a dále s fágy A511, P100 (Listeria monocytogenes) a LP65 (Lactobacillus plantarum). Polyvalentní stafylokokové bakteriofágy z čeledi Myoviridae se v posledních letech staly předmětem zájmu s ohledem na jejich možné praktické využití při fágové terapii, která představuje vhodnou alternativu antibiotikové léčby stafylokokových infekcí. Práce byla zaměřena na analýzu proteinové struktury virionů fága 812 na jeho srovnání s proteomy příbuzných fágů a mutant v rozmezí hostitele. Pomocí jedno- a dvourozměrné gelové elektroforézy (1-DE a 2-DE) a následným peptidovým mapováním (PMF) bylo identifikováno celkem 24 proteinů fága 812. Uvedený metodický přístup umožnil identifikovat 20 nových proteinů, které dosud nebyly nalezeny při analýze proteomu fágů K a G1. Patnáct proteinů bylo jednoznačně přiřazeno ke genům náležejícím do strukturního genomového modulu, zbývajících devět je kódováno geny levého a nebo pravého ramena fágového genomu. Mezi nejvíce abundantní proteiny patří hlavní kapsidový protein (mcp; 51.2 kDa), hlavní protein bičíkové pochvy (mtsp; 64.5 kDa) a proteiny přirazené k ORF 50 (15.9 kDa) a ORF 95 (23.2 kDa) fága K. Protein bičíkové pochvy se vyskytuje na gelech v několika formách lišících se elektroforetickou mobilitou, což pravděpodobně souvisí s procesem s kontrakce fágového bičíku. Srovnávací proteomová analýza fágů 812, 812b, 812p a SK311 prokázala, že 2-DE proteinové profily těchto fágů se liší ve více než jednom stu skvrn. Rozdíly byly nalezeny především u proteinů ORF 66 a ORF 68, které jsou součástí bičíkových struktur a mohou tedy podstatným způsobem ovlivňovat rozmezí hostitele fága. U studovaných fágů byla nalezena bičíková hydroláza. Tento lytický protein o molekulové hmotnosti 91.2 kDa obsahuje CHAP doménu a má výrazný terapeutický potenciál. Dosažené výsledky přispívají k detailní charakterizaci struktury fágových virionů, jejichž znalost je nezbytná pro zavedení racionální fágové terapie.

Abstract:

Virulent and polyvalent staphylophage 812, a member of the Myoviridae family, exhibits strong lytic activity on a broad host range in the genus Staphylococcus. Genome of the phage 812 is represented by linear 145 kbp dsDNA and shows high degree of similarity with genomes of the other staphylococcal polyvalent phages K, Twort and G1 as well as those of Listeria monocytogenes phages A511 and P100, and Lactobacillus plantarum phage LP65. Polyvalent staphylococcal bacteriophages of the family Myoviridae have recently become of interest with respect to their practical application for phage therapy. This approach offers a promising alternative to antibiotic treatment of staphylococcal infections. This study was focused on the protein structure analysis of the phage 812 and the comparison of the phage 812 proteome with those of related phages and host-range mutants. Using one- and two-dimensional electrophoreses (1-DE, 2-DE) followed by peptide mass fingerprinting (PMF), 24 virion proteins were identified. Twenty new proteins, not yet identified by proteome analysis of closely related staphylococcal phages K and G1, were identified using this approach. Fifteen proteins were assigned unambiguously to the head-tail genome module; the remaining nine proteins are encoded by genes of the left or right arms of the phage genome. As expected, the most abundant proteins in the electrophoretic patterns are the major capsid protein (mcp; 51.2 kDa), the major tail sheath protein (mtsp; 64.5 kDa), and proteins assigned to ORF 50 (15.9 kDa) and ORF 95 (23.2 kDa) of phage K, although their function is only putative. The major tail sheath protein occurs in several forms with different electrophoretic mobility, what may be related to the process of a phage tail contraction. The comparative proteome analysis of phages 812, 812b, 812p and SK311 revealed, that 2 DE protein profiles of these phages differ in more than one hunderd spots. The major differences were observed in proteins ORF 66 and ORF 68, which are parts of phage tails and probably play a significant role in determination of the phage host-range. The tail hydrolase was identified in the studied phages. This lytic enzyme with molecular weight 91.2 kDa contains the CHAP domain and possesses a relevant therapeutic potential. The obtained results contribute substantially to a detailed characterization of phage virions, knowledge of which is necessary for rational phage therapy.

Kľúčové slová

bakteriofág, proteom, fágová terapie, Staphylococcus, bacteriophage, proteome, phage therapy

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 12. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 12. 2007
• Vedúci: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc.
• Oponent: prof. MUDr. Jan Šmarda, DrSc., Ing. Karel Klepárník, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology