Aplikace molekulárně biologických metod při detekci genů a degradaci vybraných mikrobiálních metabolitů v potravinách

Ing. Hana Pištěková

Doctoral thesis

Application of molecular biological methods for the detection of genes and degradation of selected microbial metabolites in foodstuffs

Abstract:

Tato disertační práce je zaměřena na detekci a kvantifikaci bakteriálních genů kódujících enzymy, jež se podílí na degradaci biogenních aminů (BA). Teoretická část předkládané práce pojednává o toxicitě BA, jejich výskytu v potravinách, faktorech, které se podílí na jejich vzniku i možnostech degradace těchto bakteriálních metabolitů. Zvláště se pak zabývá molekulárně biologickými metodami aplikovanými v potravinářství, které jsou efektivně využívány pro kontrolu producentů či degradérů těchto významných nízkomolekulárních dusíkatých látek. V experimentální části práce byla ověřována schopnost vybraných kmenů degradovat BA a na základě získaných poznatků byly navrženy primery (pro cílové i "housekeepingové" geny) pro dva bakteriální druhy: Bacillus subtilis a Lactobacillus casei. V rámci testů byly vybrány vhodné sady primerů (u kterých reakce běžely téměř se 100% efektivitou, netvořily se žádné dimery nebo nespecifické produkty) pro sledování genové exprese cílových genů (yobN kódující aminooxidázu u druhů B. subtilis; a MCO kódující "multi-copper" oxidázu u druhů L. casei), jež kódují enzymy podílející se právě na degradaci BA. K relativní kvantifikaci obou cílových genů (yobN, MCO) byly využívány optimalizované metodiky kvantitativní real-time PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR). U kmenů B. subtilis byla zaznamenaná nejvyšší genová exprese, cílového genu kódujícího aminooxidázu (yobN), v exponenciální fázi růstu (3,03 +- 0,13). Tento výsledek byl podpořen sledováním úbytku (degradací) BA v MM1, pomocí metody HPLC/UV, kdy bylo zaznamenáno snížení histaminu o 17 % a kadaverinu o 18 % u kmenu CCM 2216 během 48 hodin. Dále byla prokázána 18% degradace tyraminu u kmenu CCM 2267 během 48 hodin v tomtéž médiu. Výsledky dále naznačily, že degradace BA pomocí druhu B. subtilis může být ovlivněna tvorbou spór. I u kmenu L. casei CCDM 198 byla sledována genová exprese (relativní kvantifikace) cílového genu MCO v čase. Nejvyšší hodnota 5,04 +- 0,45 byla rovněž zaznamenaná v exponenciální fázi růstu, přičemž úbytek sledovaných BA činil 21,22 +- 4,17 %. Později byl testován i vliv redoxních činidel 1% cysteinu (w/v) a 0,1% kyseliny askorbové (w/v) na expresi genu kódujícího "multi-copper" oxidázu, tedy enzymu podílejícího se na degradaci BA. Z výsledků vyplývá, že 1% cystein (w/v) pozitivně ovlivnil růst bakterií, v důsledku čehož mírně vzrostla degradace BA (22,64 +- 3,13 %). Zatímco po přídavku 0,1% kyseliny askorbové (w/v) následoval pokles množství bakterií, exprese cílového genu i nižší degradace BA ve všech sledovaných časech. V závěru experimentu bylo ověřeno, že kmen CCDM 198 degraduje sledované BA i v reálné potravině . UHT mléce.

Abstract:

This dissertation is focused on the detection and quantification of bacterial genes encoding enzymes involved in the degradation of biogenic amines (BA). The theoretical part of the presented work deals with the toxicity of BA, their occurrence in food, the factors that contribute to their formation and the possibility of degradation of these bacterial metabolites. In particular, it deals with molecular biological methods applied in the food industry, which are effectively used for the control of producers or degraders of these important low molecular weight nitrogenous substances. In the experimental part of the thesis, the ability of selected strains to degrade BA was verified. Based on the acquired knowledge, primers (for target and housekeeping genes) were designed for two bacterial species: Bacillus subtilis and Lactobacillus casei. In the tests, suitable primer sets were selected (in which the reactions proceeded with almost 100% efficiency, no dimers or nonspecific products formed) for monitoring the relative expression of target genes (yobN encoding amine oxidase in B. subtilis species; and MCO encoding multicopper oxidase in L. casei species). These genes encode enzymes involved in BAs degradation. Optimized reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) methodologies were used for relative quantification of both target genes (yobN, MCO). The highest relative expression of the gene encoding amine oxidase (yobN) in the exponential growth phase (3.03 +- 0.13) was recorded in B. subtilis strains. This result was supported by monitoring the reduction (degradation) of BA in the mineral medium by HPLC/UV, which showed a 17% decrease in histamine and 18% cadaverine for strain CCM 2216 over 48 hours. Furthermore, 18% degradation of tyramine was demonstrated by strain CCM 2267 within 48 hours in the same medium. The results further suggested that the degradation of BA by B. subtilis may be affected by spore formation. Even with strain of L. casei CCDM 198 was monitored relative expression of the target gene (MCO) at time. The highest value of 5.04 +- 0.45 was also recorded in the exponential growth phase, with a decrease in the observed BAs of 21.22 +- 4. 17%. Later, the effect of redox reagents 1% cysteine (w/v) and 0.1% ascorbic acid (w/v) on the expression of the gene encoding multicopper oxidase, an enzyme involved in BA degradation, was tested. The results show that 1% cysteine (w/v) had a positive effect on bacterial growth, resulting in a slight increase in BA degradation (22.64 +- 3.13%). While the addition of 0.1% ascorbic acid (w/v) was followed by a decrease in the amount of bacteria, expression of the target gene and lower degradation of BA at all monitored times. At the end of the experiment, it was verified that the strain CCDM 198 degrades the monitored BA also in real food - UHT milk.

Keywords

degradace biogenních aminů, histamin, qPCR, primery, Lacto-bacillus casei, Bacillus subtilis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 7. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 22. 9. 2020

Tomas Bata University in Zlín

Faculty of Technology

Doctoral programme / field:
Food Chemistry and Technology / Food Technology