MALDI hmotnostní spektrometrie proteinů ve vzorcích vína: použití interních proteinových standardů pro kvantifikaci

Michaela RAŠKOVÁ

Bachelor's thesis

MALDI mass spectrometry of proteins in wine samples: use of internal protein standards for quantification

Abstract:

Množství proteinů ve víně dosahuje několika desítek až stovek miligramů na litr. Proteiny pocházejí z hroznů, ale také mohou pocházet z kvasinek fermentujících mošt. U bílých vín může docházet vlivem špatných skladovacích podmínek k tvorbě proteinového zákalu. Hlavními rozpustnými proteiny v lahvovém víně jsou PR proteiny ("pathogenesis related"). Množství těchto proteinů ve víně ovlivňuje řada faktorů, např. sklizeň (manuální/mechanická), doba expozice moštu hroznovým slupkám a možná mikrobiální infekce hroznů. Mezi PR proteiny, které jsou zodpovědné za vznik zákalu ve vínech, jsou chitinasy a TLP ("thaumatin like proteins"). Množství těchto skupin proteinů roste v době zrání hroznů. Jejich molekulová hmotnost se nachází v rozmezí 20-35 kDa a stejně jako ostatní PR proteiny jsou rezistentní k proteasám a nízkému pH, což jim umožňuje přežít extrémní podmínky při vinifikaci a dostat se tak do vína. Chitinasy jsou považovány za primární příčinu teplem indukovaného zákalu, jelikož ireverzibilně denaturují a agregují. TLP jsou více stabilní než chitinasy. Proces tvorby zákalu může být navíc ovlivněn i neproteinogenními složkami. V této práci jsem se zaměřila na kvantifikaci vinných TLP pomocí MALDI TOF MS ("matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry"). Vzorky bílého vína byly analyzovány přímo, po dialýze nebo byly před měřením podrobeny procedurám zahušťování proteinů. Kvantifikace na bázi MS byla dosažena porovnáním ploch píku vnitřního standardu (cytochrom c, thaumatin nebo myoglobin) a TLP v získaných hmotnostních spektrech. Bohužel, chitinasy nebylo možné tímto způsobem kvantifikovat.

Abstract:

The amount of protein in wine reaches several ten to hundred milligrams per litre. Proteins are derived from grape berries but may also come from the yeast that ferments must. White wines can cause turbidity due to inappropriate storage conditions. The major soluble proteins in bottled wine are pathogenesis-related. Their concentration is influenced by the harvesting technique used (manual/mechanical), the time of the juice exposition to grape skins and possible microbial infection of grapes. Chitinase and TLP are PR proteins which are responsible for haze forming in wine. The content of these groups of proteins increases during ripening. They show a low molecular weight of 20-35 kDa and are resistant to proteolysis as well as the acidic pH of the wine, which allows them to survive the extreme conditions of vinification and get into the wine. Chitinases are considered the primary cause of heat-induced haze formation because of their irreversible denaturation and aggregation. TLPs are more stable than chitinase. The haze-forming process can additionally be affected by non-proteinaceous wine components. In this study, I focused on the quantification of wine TLPs using matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF MS). White wine samples were analysed directly, after dialysis or they were subjected to protein concentrating procedures before measurements. MS-based quantification was achieved by comparing peak areas of an internal standard (cytochrome c, thaumatin or myoglobin) and TLPs in the acquired mass spectra. Unfortunately, chitinases could not be quantified in this way.

Keywords

Víno, PR proteiny, zákal, MALDI TOF MS, TLP, cytochrom c, myoglobin

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry