Regulation of the MAPK/ERK signaling pathway by metabolic stress in melanoma

Amandine Verlande, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

Úvod. Somatické mutace v genech BRAF a NRAS doprovázejí přibližně 45% a 17% melanomů. Tyto mutace vedou ke konstitutivní aktivaci signální dráhy MEK-ERK. Častý výskyt mutace BRAFV600E vedl k vývoji léčiv cílených na BRAF, která účinně blokovala signalizaci MEK-ERK v melanomech s mutací BRAF. Nicméně, během šesti až osmi měsíců od zahájení léčby se často projeví získaná rezistence, což ukazuje potřebu nalezení dalších terapeutických strategií pro melanom. Na rozdíl od mutované kinázy BRAF, na niž lze dobře cílit nízkomolekulárními inhibitory, klinicky účinná cílená terapie zaměřená na RAS stále není k dispozici. Proliferaci nádorových buněk často doprovází změněný buněčný metabolismus. Zaměření se na specifické metabolické potřeby těchto buněk je proto považováno za atraktivní strategii pro léčbu rakoviny. Cílem této práce bylo zhodnotit účinky známých metabolických stresorů na deregulovanou dráhu ERK v buňkách melanomu nesoucích aktivační mutace onkogenů BRAF a NRAS. Metody. K řešení výzkumných problémů bylo použito následujících metod: Molekulární biologie a biochemie: Imunoprecipitace; kinázový test in vitro; místně-cílená mutageneze; elektroforéza v akrylamidovém gelu; imunoblotování; měření množství ATP; analýza fosforylací proteinů kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií; kvantifikace intracelulárních metabolitů pomocí NMR spektroskopie; izolace RNA a analýza genové exprese pomocí qRT-PCR. Buněčná biologie: Kultivace savčích a bakteriálních buněk; přechodná a stabilní transfekce; RNA interference; měření spotřeby kyslíku a extracelulární acidifikace; stanovení životaschopnosti buněk průtokovou cytometrií; analýza buněčného cyklu a proliferace; testování účinku nízkomolekulárních látek. Výsledky. Ukazujeme, že metabolické stresory podporují dimerizaci proteinů KSR s kinázou CRAF v buňkách s mutací NRAS a s onkogenním BRAF v buňkách nesoucích mutaci BRAFV600E, což v obou případech zvyšuje aktivaci dráhy ERK. Navzdory této podobnosti však tyto dva genomové podtypy reagují odlišně, pokud je indukována vyšší hladina metabolického stresu. V buňkách nesoucích mutaci v NRAS je dráha ERK ještě více stimulována, zatímco v buňkách s mutací BRAFV600E je aktivita ERK inhibována. Ukazujeme, že tato odpověď je způsobena disociací mutantního BRAF z KSR, a že je zprostředkována aktivovanou kinázou AMPK. Oba tyto typy regulace dráhy ERK však vedou k zástavě buněčného cyklu. Proto jsme také zhodnotili možnost, že by cílení na buněčný metabolismus mohlo být vhodnou terapeutickou strategií pro oba genomické podtypy melanomu. Závěr. Metabolický stres reguluje aktivitu dráhy ERK řízením heterodimerizace KSR-RAF v buňkách BRAFV600E-mutovaných a NRAS-mutovaných melanomů.

Abstract:

Background. Somatic mutations in BRAF and NRAS genes are found in about 45% and 17% of melanomas respectively. These mutations lead to a constitutive activation of the MEK-ERK signaling pathway. The frequent occurrence of the BRAFV600E mutation led to the development of BRAF-targeted drugs which effectively block the MEK-ERK signaling in BRAF-mutant melanoma cells. However, tumor cells often acquire resistance by various mechanisms after six to eight months of therapy, demonstrating the need for additional therapeutic strategies for melanoma. Unlike the case of the druggable mutant BRAF protein, a clinically effective anti-RAS therapy remains still elusive. Proliferating cancer cells often exhibit an altered cell metabolism and targeting their specific metabolic needs is considered an attractive strategy for cancer therapy. The goal of this thesis was to evaluate the effects of well-characterized metabolic stressors on the dysregulated ERK pathway in melanoma cells bearing activating mutations of BRAF and NRAS oncogenes. Methods. A panel of methods has been employed to address diverse scientific problems: Molecular biology & Biochemistry: Immunoprecipitation; in vitro kinase assay; site-directed mutagenesis; acrylamide gel electrophoresis; immunoblotting; ATP measurements; analysis of protein phosphorylation by liquid chromatography-tandem mass spectrometry; quantification of intracellular metabolites using NMR spectroscopy; RNA isolation and gene expression analysis by qRT-PCR. Cellular biology: Mammalian and bacterial cells culture; transient and stable transfections; RNA interference; extracellular acidification rate and oxygen consumption rate measurements; flow cytometry analysis of cell viability; analysis of cell cycle progression and proliferation; small molecule drug testing. Results. We report that metabolic stressors promote dimerization of KSR proteins with CRAF in NRAS-mutant cells and with oncogenic BRAF in BRAFV600E-mutant cells, enhancing ERK pathway activation. Despite this similarity, the two genomic subtypes respond differently when higher levels of metabolic stress are induced. In NRAS-mutant cells, the ERK pathway is even more stimulated, while it is strongly downregulated in BRAFV600E-mutant cells. We demonstrate that this response is caused by the dissociation of mutant BRAF from KSR and is mediated by activated AMPK kinase. Nevertheless, these two different types of ERK regulation both lead to cell cycle arrest. Therefore, we also evaluated the possibility that metabolic targeting might be a therapeutic strategy suitable for both genomic melanoma subtypes. Conclusions. Metabolic stress regulates the activity of the ERK pathway by controlling KSR-RAF heterodimerization in BRAFV600E- and NRAS-mutant melanoma cells.

Keywords

Metabolický stres, Metabolic stress, melanom, melanoma, CRAF, BRAFV600E, KSR, AMPK, glutamin, glutamine, buněčné přežití, cell survival, zástava buněčného cyklu, cell cycle arrest.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 12. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 25. 1. 2018
• Supervisor: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology