Metody detekce replikační aktivity lidských buněk a standardizace jejich použití pro analýzu buněčného cyklu

Anna KABOTOVÁ

Bachelor's thesis

Methods of determination of replicational activity of human cells and standardization of their use for the analysis of the cell cycle

Abstract:

Předkládaná práce poskytuje přehled několika metod používaných pro detekci replikační aktivity buněk s využitím modifikovaných nukleosidů (5-bromo-2´-deoxyuridinu, BrdU a 5-etynyl-2´-deoxyuridinu, EdU) a nukleotidu (biotin-16-deoxyuridin-5´-trifosfátu). Součástí práce je porovnání těchto metod s ohledem na možnost provedení následné analýzy buněčného cyklu, na sílu poskytovaného signálu a na jejich vliv na fluorescenci fluorescenčních proteinů. Sledované metody byly testovány na pěti lidských buněčných liniích. Výsledky ukázaly, že z testovaných metod byl pro analýzu replikační aktivity a současně analýzu buněčného cyklu buněk nejvhodnější nukleosid EdU, který je detekován klikací reakcí. Naopak nejméně vhodnou metodou bylo použití BrdU v kombinaci s jeho odhalením ve struktuře DNA pomocí 4 N HCl. Tento způsob vedl k denaturaci DNA, což znemožnilo následnou analýzu buněčného cyklu. Pro současnou lokalizaci fluorescenčních proteinů byla nejvhodnější metoda založená na BrdU a působení nukleáz.

Abstract:

The thesis presented provides a review of several methods used for the detection of cellular replicational activity by modified nucleosides (5-bromo-2´-deoxyuridine, BrdU and 5- ethynyl-2´-deoxyuridine, EdU) and nucleotide (biotin-16-deoxyuridine-5´-triphosphate). A part of the thesis concerns the comparison of these approaches with respect to the possibility of subsequent cell cycle analysis, the signal strength and their impact on the fluorescence of the fluorescence proteins as well. The investigated methods were tested on five human cell lines. The results showed that nucleoside EdU detected by click reaction was the most suitable nucleoside for analysis of replicational activity and the concurrent cell cycle analysis. On the other hand, the least suitable approach represents the use of BrdU in combination with its revelation in DNA structure by 4 N HCl. This method led to the DNA denaturation making impossible the subsequent analysis of the cell cycle. Method based on BrdU and nucleases treatment emerged as the most convenient for the simultaneous analysis of fluorescent proteins.

Keywords

Replikace DNA, modifikované nukleosidy a nukleotidy, buněčný cyklus, imunofluorescence, obrazová cytometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 5. 2021

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Anna Ligasová, PhD.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology