Bioelectrochemistry in molecular oncology

Ravery Jovinary Sebuyoya, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Nádorová onemocnění jsou jednou z hlavních příčin úmrtí na celém světě, s odhadovanými 19,3 miliony nových případů a 10 miliony úmrtí ročně. Správná diagnostika vyžaduje detekci různých nádorových biomarkerů, včetně těch na bázi nukleových kyselin, jako jsou např. bodové mutace v DNA, metylace DNA a RNA, nebo onkoviry. I když jsou standardní metody pro detekci těchto biomarkerů, jako je sekvenování nové generace a PCR techniky, vysoce přesné, jsou také drahé, časově náročné a vyžadují kvalifikovanou práci pro analýzu dat. Proto je potřeba vyvinout alternativní metody, které by tyto omezení řešily. Tato disertace je rozdělena do několika částí, z nichž každá zahrnuje různé podtémata. První část poskytuje historický přehled a definici rakoviny, následují globální statistiky rakoviny a klasifikace biomarkerů na základě stavu onemocnění a biomolekul. Druhá část představuje vybrané biomarkery, včetně základní virové struktury a diagnózy lidských papilomavirů (HPV), mutací v genech KRAS nebo BRAF jako prediktory léčby, nebo metylace RNA. Následně jsou shrnuty nejběžnější metody detekce nukleových kyselin, včetně PCR technik, jako jsou real-time PCR, systém amplifikace specifický pro mutace (ARMS-PCR), digitální kapková PCR, anebo sekvenování nové generace. Vzhledem k omezením těchto standardních metod disertace poté zkoumá izotermální amplifikační techniky, jako je amplifikace valivou kružnicí (RCA), LAMP amplifikace (z angl. loop-mediated amplification) a rekombinázová polymerázová amplifikace (RPA). Následující část představuje elektrochemické biosenzory a různé elektrochemické detekční techniky, včetně chronoamperometrie/amperometrie, voltametrie, cyklické voltametrie, pulzní voltametrie a square wave voltametrie. Poslední část úvodu diskutuje různé strategie povrchové modifikace pro elektrochemické biosenzory, včetně samouspořádaných monovrstev, elektrodepozice, kovalentního vazebného spojení na povrch elektrody a modifikací pomocí EDC-NHS chemie a avidin-biotinové interakce. Diskusní část představuje několik kritických přehledů o metylaci DNA, bodových mutacích DNA a pokročilých diagnostických strategiích. Disertace také podrobně popisuje vývoj testů pro detekci HPV 16 a 18 v buněčných lyzátech pomocí magnetických kuliček a další metodu bez magnetických kuliček využívající zlaté elektrody. Dále popisuje test pro detekci mutace BRAF(V600E) pomocí RCA reakce a LNA-modifikovaných magnetických kuliček a test pro detekci metylace mikroRNA. Tyto nové metody, neboli testy, byly aplikovány na buněčné linie a klinické vzorky, aby se prokázala jejich účinnost při detekci těchto biomarkerů.

Abstract:

Cancer is one of the leading causes of death worldwide, with an estimated 19.3 million new cancer cases and 10 million deaths annually. Proper diagnostics require detecting diverse cancer biomarkers, including those based on nucleic acids, such as DNA point mutations, DNA or RNA methylation or oncoviruses. Although the gold standard methods for detecting these biomarkers, such as next-generation sequencing and PCR-based techniques, are highly accurate, they are also expensive, time-consuming, and require skilled personnel for data analysis. Therefore, there is a need to develop alternative methods to address these limitations. This dissertation is organized into several parts, each encompassing various subtopics. The first part provides a historical overview and definition of cancer, followed by global cancer statistics and the classification of biomarkers based on the disease state and biomolecules. The second part introduces selected biomarkers, including the basic viral structure and diagnosis of human papillomavirus (HPV) as a major cause of cervical cancer, KRAS and BRAF gene mutations involved in therapy response, and RNA methylation. Subsequently, the most common methods for detecting nucleic acid cancer biomarkers are summarized, including PCR-based techniques such as real-time PCR, amplification refractory mutation system (ARMS-PCR), digital droplet PCR, and next-generation sequencing. Given the limitations of these standard methods, the dissertation then explores isothermal amplification techniques such as rolling circle amplification (RCA), loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and recombinase polymerase amplification (RPA). The following section introduces electrochemical biosensors and various electrochemical detection techniques, including chronoamperometry/amperometry, voltammetry, cyclic voltammetry, pulse voltammetry, and square wave voltammetry. The final part of the introduction discusses various surface modification strategies for electrochemical biosensors, including self-assembled monolayers, electrodeposition, covalent coupling to the electrode surface, and modifications using EDC-NHS chemistry and avidin-biotin interaction. The discussion section presents several critical reviews on DNA methylation, DNA point mutations, and advanced diagnostic strategies. The dissertation also details the development of assays for detecting HPV 16 & 18 in crude lysates using magnetic beads and another assay on the gold screen-printed electrode without the beads. Additionally, it describes an assay for detecting the BRAF(V600E) mutation using rolling circle amplification and LNA-modified magnetic beads and a developed assay for detecting microRNA methylation status. These assays were applied to cell lines and clinical samples to demonstrate their effectiveness in detecting these biomarkers.

Keywords

rakovina, isotermální amplifikace, elektrochemie, biomarkery cancer, isothermal amplifications, electrochemistry, biomarkers

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 7. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 19. 8. 2024
• Supervisor: Mgr. Martin Bartošík, Ph.D.
• Reader: RNDr. Aleš Daňhel, Ph.D., Mgr. Karel Lacina, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics