Význam různých izoforem adenylátcykláz ve fyziologické funkci buněk

Mgr. Petra Daďová, Ph.D.

Doctoral thesis

Importance of different adenylyl cyclase isoforms in the physiological function of cells

Abstract:

Adenylylcyklázy (AC) patří do rodiny enzymů, které katalyzují syntézu cyklického adenosin-3',5'-monofosfátu (cAMP), sekundárního posla účastnícího se různých fyziologických a patofyziologických procesů. Dosud bylo identifikováno deset izoforem AC, devět membránově vázaných a jedna rozpustná cytosolická. Izoformy AC se liší tkáňovou distribucí a způsobem jak mohou být regulovány. Většina dostupných léků, které cílí na cAMP signální dráhu, působí jako ligandy receptorů spřažených s G-proteiny (GPCR) nebo jako inhibitory fosfodiesteráz (PDE). V posledních dvou desetiletích se však také AC začaly považovat za potenciální farmakologické cíle. Studie se začaly zaměřovat na objevení izoformově specifických inhibitorů nebo aktivátorů AC. Hlavní sloučeninou pro generování nových aktivátorů AC je forskolin (FSK), labdanový diterpen známý jako neselektivní aktivátor AC1-AC8. Předpokládá se, že modifikace na C6, C7 nebo C13 by mohla vést k určité izoformové specifitě při zachování stimulačního účinku FSK derivátů. Nalezení takového modulátoru, který by specificky reguloval konkrétní izoformu AC, by mohlo vést k vývoji nových léčiv pro léčbu patologických stavů spojených se změněnými hladina-mi intracelulárního cAMP. Předpokládá se, že cAMP má imunomodulační účinky, nicméně specifické účinky zvýšených hladin cAMP na diferenciaci a funkce pomocných T (Th) lymfocytů jsou stále nejasné. Nerovnováha mezi subpopulacemi Th1, Th2 a Th17 je spojena se rozvojem chronických zánětlivých procesů, zejména autoimunitních onemocnění. Diferenciace různých Th subpopulací tedy může být modulována prostřednictvím intracelulárního zvýšení cAMP způsobeného aktivací AC pomocí FSK. To by mohlo vést k objevu nových terapeutických cílů pro léčbu imunitních poruch souvisejících s Th lymfocyty. Tato práce je zaměřena na vývoj screeningové technologie pro testování modulace aktivity AC. Připravili jsem a následně charakterizovali kompletní panel HEK293 klonů nadměrně exprimujících jednotlivé izoformy AC citlivé na stimulaci FSK (AC1-8). Stanovení produkce cAMP bylo provedeno pomocí TR-FRET na základě měření kompetitivní interakce nově vyprodukovaného cAMP s cAMP značeným fluorochro-mem. Vyvinuli jsme dva typy testů pro detekci cAMP, jeden založený na izolovaných membránových frakcích a druhý založený na suspenzi buněk. Hodnotili jsme účinky 36 nově syntetizovaných unikátních derivátů FSK, které byly syntetizovány organickými chemiky doc. Paruchem a Dr. Švendou Molekula FSK byla modifikována v pozicích C4, C7 a C13 a efektivita FSK derivátů byla analyzována u všech AC klonů pomocí buněčných testů. Druhým cílem práce bylo vyhodnocení účinků zprostředkovaných FSK na diferenciaci Th1, Th2 a Th17 subpopulací. Nejprve jsme optimalizovali celý proces izolace lymfocytů z krve zdravých dárců a buněčného třídění Th naivních buněk spolu s aktivací a diferenciací do jednotlivých subpopulací. Následně jsme optimalizovali metodiku RNA sekvenování jednotlivých buněk diferencovaných Th lymfocytů. Podrobná analýza transkriptomu umožnila odhalit heterogenitu dárců a objevit nové signaturní geny specifické pro Th1, Th2 a Th17 subpopulace. Následně jsme použili FSK pro studium zapojení cAMP do diferenciace jednotlivých Th subpopulací. Exprese AC izoforem a PDE, enzymů odpovědných za degradaci cAMP, jsme analyzovali v diferencovaných Th lymfocytech. FSK zprostředkoval zvýšení Th1-specifických markerů upevňující fenotyp Th1 buněk. Th2 diferenciace byla podporována pomocí FSK, ačkoli buněčný metabolismus byl negativně ovlivněn. Naproti tomu imunofenotyp Th17 byl silně potlačen, což vedlo k vysoce specifickému zvýšení hladiny CXCL13. Celkově se dá shrnout, že zvýše

Abstract:

ní cAMP zprostředkované pomocí FSK má vliv na diferenciaci Th1, Th2 a Th17 subpopulací a může přispět k identifikaci nových terapeutických cílů pro léčbu patologických procesů souvisejících s Th lymfocyty. Závěrem lze říci, že získané výsledky naplňují stanovené cíle a práce přináší jak nové poznatky o regulační úloze cAMP signalizace v diferenciaci Th buněk, tak o potenciálu unikátních derivátů FSK modulovat specifické izoformy AC. Jsou zapotřebí další studie, které by ukázaly potenciál specifických nových FSK derivátů a jejich vy-užití jako nových imunomodulačních léčiv.

Abstract:

Adenylyl cyclases (AC) belong to the family of enzymes that catalyze the synthesis of cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP), a secondary messenger involved in various physiological and pathophysiological processes. To date, ten different AC isoforms have been identified, nine membrane-bound and one soluble cytosolic. The AC isoforms differ in their tissue distribution and in the way of regulation. Most of the available drugs that target the cAMP signaling pathway act as ligands of G protein-coupled receptors (GPCRs) or as phosphodiesterase (PDE) inhibitors. However, during the last two decades, ACs have also begun to be considered as potential drug targets. Thus, the studies started to focus on the discovery of isoform-specific inhibitors or activators. The leading compound for the generation of new AC activators is forskolin (FSK), a labdane diterpene well-known as a non-selective activator of AC1-AC8. It was suggested that modification on the C6, C7, or C13 could lead to some isoform-specificity while preserving the stimulatory effect of FSK derivatives. Finding such a modulator that would specifically regulate a particular AC isoform could lead to the development of new drugs for the treatment of pathologies associated with altered levels of intracellular cAMP. The cAMP was suggested to have immunomodulatory effects, however, the specific effects of elevated cAMP levels on T helper (Th) cell differentiation and functions are still unclear. The imbalance between Th1, Th2, and Th17 subsets is associated with the onset of chronic inflammatory processes, especially autoimmune diseases. Thus, the differentiation of distinct Th subsets may be modulated through intracellular cAMP elevation caused by the FSK-mediated AC activation. This could lead to the discovery of new therapeutic targets for the treatment of Th-related immune disorders. This thesis is focused on the development of screening technology for the testing of AC activity modulation. We prepared and characterized a full panel of human HEK293 clones overexpressing individual AC isoforms sensitive to FSK stimulation (AC1-8). The determination of newly produced cAMP was determined by TR-FRET based on endpoint measurement of the competitive interaction of newly formed cAMP with fluorochrome-labeled cAMP. Moreover, were developed two types of assays, one based on the isolated membrane fractions and the other based on the whole cell suspension. We evaluated the effects of 36 newly synthesized unique FSK derivatives, which were prepared by the medicinal chemists Assoc. Prof. Paruch and Dr. Švenda. The FSK molecule was modified at the C4, C7, and C13 positions, and the FSK derivatives were tested against all AC clones in the cell-based assay. The second goal of the thesis covered the evaluation of FSK-mediated effects on the differentiation of Th1, Th2, and Th17 subsets. Firstly, we optimized the whole process of lymphocyte isolation from the blood of healthy donors and cell sorting of Th naive cells together with activation and differentiation into particular subsets. Subsequently, we optimized the pipeline of single-cell RNA-sequencing analysis of differentiated Th cells. The detailed analysis of transcriptome allowed us to reveal the donor heterogeneity and to discover the novel signature genes specific to Th1, Th2, and Th17 subsets. Finally, FSK was used to study the involvement of cAMP in the Th cell differentiation program. We analyzed the expression of AC isoforms and PDEs, enzymes responsible for the degradation of cAMP, in differentiated human Th cells. FSK mediated elevation in Th1-specific markers reinforcing the Th1 cell phenotype. The Th2 differentiation was supported by FSK, though cell metabolism was negatively affected. In contrast, the Th17 immunophenotype was severely suppressed leading to a highly specific increase in the level of CXCL13. Overall, an FSK-mediated cAMP increase has an effect on Th1, Th2, and Th17 differentiation and can contribute

Abstract:

to the identification of novel therapeutic targets for the treatment of Th cell-related pathological processes. In conclusion, the obtained results fulfill the defined goals and the thesis brings new knowledge about the regulatory role of cAMP signaling in Th cell differentiation as well as about the potential of unique FSK derivatives to modulate specific AC isoforms. Further studies are needed to show the potential of specific new FSK derivatives to be employed as new immunomodulatory drugs.

Keywords

cAMP, adenylátcykláza, forskolin, deriváty forskolinu, Th1, Th2, Th17, adenylyl cyclase, forskolin derivatives

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 11. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 19. 1. 2024
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Jiří Hrdý, Ph.D., prof. Jens Volker Stein, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology