Molecular Modelling of Enzymes’ Substrate Specificity

Mgr. Lukáš Daniel, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Disertační práce popisuje využití technik molekulového modelování pro studium a modifikaci substrátové specificity halogenalkandehalogenas (HLD), hydrolytických enzymů štěpících vazbu mezi uhlíkem a halogenem v řadě halogenovaných uhlovodíků. HLD jsou průmyslově atraktivní biokatalyzátory s dobře prostudovaným reakčním mechanismem, díky čemuž jsou hojně využívány pro testování protokolů molekulového modelování. Úvodní kapitola přibližuje čtenáři kromě struktury, funkce a nových biotechnologických aplikací HLD také dva typy metod pro rozšíření substrátové specifity enzymů: (i) identifikaci nových substrátů či inhibitorů přírodních enzymů prostřednictvím virtuálního screeningu a (ii) racionální inženýrství vazebných míst enzymů a jejich přístupových cest. V poslední době narostl zájem o identifikaci a experimentální charakterizaci nových HLD za účelem jejich průmyslového využití. Nicméně spektrum jejich prozatím popsaných substrátů zahrnovalo pouze krátké lineární či cyklické halogenované alkany a jejich deriváty. Za účelem lepšího poznání substrátové specificity těchto enzymů byla vyvinuta nová in silico metoda. Tato metoda byla použita ke screeningu více než 40000 halogenovaných látek s dosud necharakterizovanou HLD DmmA (kapitola 1). Z 16 molekul vybraných pro experimentální testování bylo správně předpovězeno 50% substrátů a 100% molekul schopných vazby do aktivního místa. Na rozdíl od známých susbtrátů HLD vykazovaly nově identifikované molekuly průměrně o 50% větší molekulovou hmotnost a přítomnost aromatických skupin. DmmA přeměňovala tyto molekuly se shodnou nebo vyšší katalytickou aktivitou než známé substráty. Tři nové molekuly byly substráty i pro další tři HLD, což indikuje katalytickou všestrannost těchto enzymů. Molekuly odvozené od nově objevených substrátů mají nejvyšší afinitu k HLD ve srovnání se všemi dosud testovanými substráty. HLD byly identifikovány v baktériích zahrnující i symbionty a patogeny jak rostlin, tak lidí. Biologická role HLD v těchto organismech však není zřejmá. Vývoj inhibitorů HLD sloužících jako molekulární próby pro prozkmoumání jejich funkce tak představuje významný krok k pochopení role této enzymové rodiny. Kapitola 2 popisuje první systematické hledání inhibitorů HLD s využitím dvou odlišných přístupů. První vycházel ze struktur známých substrátů a vedl k objevení málo účinných nespecifických inhibitorů. Druhý přístup zahrnoval virtuální screening 140000 potenciálních inhibitorů vůči HLD z lidského patogenu Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Nejlepší objevený inhibitor vykázal vysokou afinitu vůči testované HLD, inhibiční konstantu rovnu 3 µM a molekulární architekturu odlišnou od známých substrátů. Nově objevené inhibitory najdou uplatnění při studiu funkcí HLD v baktériích, či jejich katalytických mechanismů a také při stabilizaci HLD během skladování a krystalizace. Analýza krystalové struktury HLD DbeA odhalila unikátní druhé vazebné místo pro chloridový aniont. K ověření jeho funkce bylo použito inženýrství aktivního místa DbeA, při kterém byl navrhnut a zkonstruován dvoubodový mutant (DbeA ΔCl) bez tohoto vazebného místa (kapitola 3). Absence krystalové struktury DbeA ΔCl vedla k využití molekulového modelování při studiu vlivu mutací na druhé vazebné místa pro chloridy. Modelovaní navrhlo, že vazba chloridu je vhodnější v přirozené formě DbeA než v DbeA ΔCl, což bylo následně potvrzeno stopped-flow fluorescenčním měřením. Eliminace druhého vazebného místa pro chloridy v mutantu DbeA ΔCl vedla ke změně substrátové specificity, snížení katalytické aktivity a termodynamické stability a také k odstranění substrátové inhibice. Zm

Abstract:

ěny v katalytické aktivitě studované pomocí molekulového modelování a kinetických experimentů nastaly v důsledku zpomalení hydrolytického kroku, které je připisováno nižší bazicitě katalytického histidinu v DbeA ΔCl. V přírodě existuje mnoho enzymů, které svou substrátovou specificitu upravují tím, že nutí projít substrát do aktivního místa skrz přístupové tunely. Na tomto základě byl definován „lock-keyhole-key“ model, který vnesl do tradičních modelů enzymové katalýzy prvky popisující důležitost tvaru a fyzikálně-chemických vlastností přístupových cest. Kapitola 4 popisuje vývoj bioinformatického nástroje CAVER Analyst 1.0, který umožňuje analýzu a vizualizaci proteinových tunelů s cílem usnadnit studium transportu molekul a design nových biokatalyzátorů a farmaceutik. Koncept inženýrství proteinových tunelů byl aplikován při studiu strukturně-funkčních vztahů psychrofilní HLD DmxA pocházející z bakterie, která kolonizuje jezero na Antarktidě (kapitola 5). DmxA paradoxně vykazuje nejvyšší termální stabilitu (Tm = 65.9 °C) ze všech dosud charakterizovaných přirozených HLD. Analýza krystalové struktury DmxA odhalila velmi úzké přístupové tunely vedoucí do aktivního místa v tomto proteinu. Za účelem otevření hlavního tunelu byly in silico mutovány čtyři aminokyseliny tvořící jeho nejužší místo za menší residua. Efekt dvou substitucí byl předpovězen jako strukturně destabilizující, kdežto u zbylých dvou jako neutrální. Experimentální charakterizace dvou-bodového mutantu obsahujícího strukturně destabilizující mutace odhalila zlepšení aktivity, změnu substrátové specificity a snížení termální stability (Tm = 56.9 °C) při srovnání s původní DmxA. Kapitola 6 popisuje důležitost přístupových tunelů ve farmaceuticky významných biomolekulách. Mnoho proteinových rodin obsahuje stejná katalytická rezidua a velmi konzervovaná aktivní místa, avšak jejich přístupové tunely jsou odlišné. Inhibitory specificky cílící na proteinové tunely tak představují neprozkoumanou a účinnou cestu k vývoji nových léčiv. Tato kapitola předkládá čtenáři příklady inhibitorů blokujících tunely ve farmakologicky zajímavých cílech s možným využitím jako nová léčiva proti zánětlivým a neurodegenerativním onemocněním, patogenům, ateroskleróze či různým typům rakovin.

Abstract:

This Thesis describes an application of molecular modeling tools to study and modify the substrate specificity of haloalkane dehalogenases (HLDs), hydrolytic enzymes cleaving the carbon-halide bonds in a variety of halogenated hydrocarbons. HLDs are industrially attractive biocatalysts with a well-understood reaction mechanism that often serve as a benchmark for testing of different molecular modeling protocols. The Introduction of the Thesis provides an overview of structure, function and industrial applications of HLDs as well as two sets of methods broadening the substrate scope of enzymes: (i) identification of novel substrates or inhibitors of natural enzymes by virtual screening and (ii) rational engineering of the enzymes’ active sites and their access pathways. Despite the broad interest in the identification and characterization of novel HLDs, the reported substrate range covers only short-chain aliphatic linear or cyclic haloalkanes and their derivatives. To further explore the substrate scope, an in silico method tested by screening more than 40,000 halogenated compounds against the previously uncharacterized HLD DmmA was newly developed (Chapter 1). The correct prediction of 50 % substrates and 100 % binders from 16 compounds proposed for experimental testing was observed. The new substrates comprised aromatic moieties and on average 50 % higher molecular weight than the common substrates of HLDs. DmmA transformed these molecules with the comparable or higher catalytic activity then other substrates. Three novel substrates were also converted by three other HLDs suggesting a catalytic robustness of these enzymes. Derivatives of the identified substrates possess the highest affinity ever observed in this protein family. HLDs have recently been discovered in a number of bacteria, including symbionts and pathogens of both plants and humans. However, the biological roles of HLDs in these organisms are unclear. The development of efficient HLD inhibitors serving as molecular probes to explore their function would represent an important step toward a better understanding of these interesting enzymes. The Chapter 2 describes the first systematic search for HLD inhibitors using two different approaches. The first built on the structures of the enzymes’ known substrates and led to the discovery of less potent nonspecific HLD inhibitors. The second approach involved the virtual screening of 140,000 potential inhibitors against the crystal structure of HLD from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis H37Rv. The best inhibitor exhibited high specificity for the target structure, with an inhibition constant of 3 µM and a molecular architecture that clearly differs from those of all known HLD substrates. The new inhibitors will be used to study the natural functions of HLDs in bacteria, to probe their mechanisms, and to achieve their stabilization.The active site engineering was used to assess the role of a unique second halide-binding site identified in the crystal structure of HLD DbeA (Chapter 3). Since the determination of the structure of the two-point mutant (DbeA ΔCl) lacking this site was not successful, disruption of the second-halide binding site was studied by molecular modeling. The modeling suggested that the binding of a chloride into the second-halide binding site was more favorable in the wild-type enzyme than in DbeA ΔCl which was subsequently confirmed by stopped-flow fluorescence measurement. The elimination of the second-halide binding site in DbeA ΔCl shifted the substrate specificity, lowered the catalytic activity and thermostability and eliminated the substrate inhibition. The changes of the catalytic activity studied by molecular modeling and kinetic experiments were attributed to deceleration of the rate-limiting hydrolytic step mediated by the lower basicity of the catalytic histidine in DbeA ΔCl. Fine-tuning of substrate specificity of many enzymes has been achieved by forcing the incom

Abstract:

ing substrate to pass through an access tunnel before reaching the deeply buried active site. This newly proposed „lock-keyhole-key” model introduces in the traditional models of catalysis the geometry and physicochemical properties of the access tunnels to assure the selection of substrates. The Chapter 4 describes a development of CAVER Analyst 1.0, a software tool enabling analysis and visualization of protein tunnels to facilitate the study of molecular transportation and the design of novel catalysts or effective drugs. The concept of tunnel engineering was applied in the structure-function studies of a psychrophilic HLD DmxA originating from a bacterium naturally occurring in an Antarctic lake (Chapter 5). DmxA possesses paradoxically the highest thermostability (Tm = 65.9 °C) ever observed in any wild-type HLD. Analysis of the DmxA’s crystal structure revealed narrow access tunnels of this protein. To open the main tunnel, four residues forming the tunnel bottleneck were in silico mutated to smaller amino acids. The effect of two substitutions was predicted as destabilizing while the effect of the other two was predicted as neutral. Experimental characterization of a mutant with introduced destabilizing mutations revealed improved overall activity, shifted substrate specificity and lower thermostability (Tm = 56.9 °C) than the wild-type DmxA. The Chapter 6 describes the importance of the access tunnels in the pharmaceutically relevant biomolecules. Many protein families possess the same catalytic residues and the highly conserved active sites, but the composition of their access tunnels differs. Thus, inhibitors specifically targeting protein tunnels might represent an unexploited and efficient way for the development of novel drugs. The chapter shows examples of inhibitors blocking the tunnels of pharmacological targets that might be utilized as novel drugs against inflammation, neurodegenerative disorders, pathogens, atherosclerosis, immunosuppression and various cancers.

Keywords

biokatalýza, substrátová specifita, halogenalkandehalogenasy, virtuální screening, proteinové inženýrství, proteinový tunel

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 4. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2016
• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Reader: RNDr. Petr Kulhánek, Ph.D., doc. Mgr. Daniel Svozil, Ph.D., doc. RNDr. Karel Berka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Ekotoxicology