Stárnutí rybích oocytů a modifikace histonů

MSc. Swapnil Gorakh WAGHMARE

Doctoral thesis

Fish oocyte ageing and histone modifications

Abstract:

Buněčné stárnutí oocytů je charakterizováno ztrátou funkčních schopností v průběhu času. Epigenetické změny jsou jedním z faktorů, které přispívají k procesu stárnutí oocytů. Epigenetické regulátory, jako je methylace DNA, modifikace histonů a nekódující RNA, řídí aktivitu buněčného genu bez změny základní sekvence DNA. Modifikace histonů patří mezi nejdůležitější a nejběžnější epigenetické konfigurace, které hrají klíčovou roli a významně ovlivňují úspěšnost vývoje těsně po oplození a při raném vývoji embryí. Každý oocyt obsahuje hlavní a zásadní informace, které jsou potřebné k průběhu a vývoji embryogeneze a k přestavbě rodičovských genomů. Základní molekulární procesy a dráhy způsobující stárnutí oocytů zůstávají však stále neznámé. Z tohoto důvodu je zapotřebí se nadále věnovat výzkumu, sledování a porozumění molekulárním mechanismům, které jsou zodpovědné za proces stárnutím oocytů. Tématem této disertační práce byl výzkum a sledování procesu stárnutí oocytů u ryb se zaměřením na modifikaci histonů. Vedle toho byl také sledován a zkoumán fenotyp oocytů a jejich funkční změny během stárnutí. V práci byly především využívány oocyty dánia pruhovaného (Danio rerio) jako významného modelového organismu, u kterého prozatím vliv stárnutí oocytů na ploidní abnormality embryií nebyl studován. Proto toto téma bylo součástí této práce. Ovšem především byla sledována a zkoumána modifikace histonů v molekulární analýze se zvláštním zaměřením na acetylaci histonů. Aby došlo k získání více informací o dynamice acetylace histonů během stárnutí rybích oocytů, začala být hodnocena aktivita histon acetyltransferázy. Oocyty dánia pruhovaného, která byla uchována při 26 °C po dobu 2 hodin po jejich umělém výtěru (HPV), vykázala plnou oplozeníschopnosti bez jejich výrazného snížení. U oocytů tohoto druhu byla pozorována téměř úplná ztráta jejich životaschopnosti a oplozeníschopnosti až po 6 HPV. Kromě toho byly u všech larev, které byly získané z oocytů uchovávaných 4 a 6 HPV, pozorovány morfologické abnormality. Ve srovnání s oocyty, které byly uchovávány jen 0 a 2 HPV, byl podíl ploidních abnormálních embryí dania pruhovaného významně vyšší u oocytů uchovávaných 4 HPV. Míra přežití embryí v očních bodech a míra líhnivosti se významně snížila v průběhu postupného stárnutí oocytů u kapra obecného (Cyprinus carpio). U amura bílého (Ctenopharyngodon idella) byl pozorován významný pokles míry přežití embryí již u oocytů, které byly uchovávány 1 HPV. Specifická acetylace histonů na H3K9, H4K5 a H4K8 nevykazovala významné rozdíly u různě starých oocytů kapra obecného a amura bílého. Histony H3K14ac a H4K16ac nevykázaly žádný projev změny ani u čerstvých a ani u starších oocytů kapra obecného a amura bílého. Histon H4K12ac výrazně zvýšil acetylaci u ocytů kapra obecného držených 28 HPV, zatímco stejný histon u oocytů amura bílého výrazně snížil acetylaci po 1 a 4 HPV. Aktivita histon acetyltransferázy (HAT) vykazovala rostoucí trend během procesu stárnutí u in vivo a in vitro držených oocytů kapra obecného. Aktivita HAT se u oocytů amura bílého výrazně zvýšila po 30 HPS. Získané výsledky týkající se acetylace histonu mají druhově specifický charakter a jsou závislé na stavu oocytu. Tyto získané výsledky jsou prvními vyýsledky, které popisují přítomnost H3K9ac, H4K5ac, H4K8ac a H4K12ac, stejně jako nepřítomnost H3K14ac a H4K16ac v metafáze II oocytech kapra obecného a amura bílého. Další výzkum zabývající se modifikací histonů a souvisejících genomových oblastí u různě uchovávaných a starých oocytů bude velmi užitečný pro další vysvětlení zákoni

Abstract:

Cellular ageing is characterized by a loss of functional abilities over time. Epigenetic changes are one of the factors that contribute to ageing. Epigenetic regulators control the cellular gene activity without any alteration of the underlying DNA sequence. Epigenetic regulators like DNA methylation, histone modifications, and non-coding RNAs have been related to the ageing process. Histone modifications are among the most crucial and common epigenetic configurations that play a critical role in the post-fertilization success and early embryo development. Oocyte carries essential information to orchestrate embryogenesis and to remodel the parental genomes. The underlying molecular pathways driving oocyte ageing remain unknown. Investigations and understanding of the molecular mechanisms behind oocyte ageing are needed. Therefore, the investigation of the oocyte ageing, focusing on histone modifications were done. Egg phenotype and functional changes during fish oocyte ageing were examined. Despite being widely used as a model organism, the impact of oocyte ageing on ploidy abnormalities was not yet studied in zebrafish (Danio rerio). Therefore, the investigation on ploidy anomalies in embryos originating from different aged oocytes in zebrafish was performed. In the molecular analysis, histone modifications with a special focus on acetylation were performed. Histone acetyltransferase activity was assessed to get more information on the dynamics of histone acetylation during fish oocyte ageing. The current study reports that maintenance and manipulation of zebrafish oocytes at 26 °C for 2 hours post-stripping (HPS) was possible without significantly reducing fertilization potential. Almost complete loss of egg viability was observed at 6 HPS in zebrafish. In addition, physical abnormalities were observed in all larvae derived from 4 and 6 HPS-old oocytes. Compared to 0 and 2 HPS, the proportion of ploidy abnormal embryos was significantly greater at 4 HPS in zebrafish. The egg eyeing and hatching rates were significantly decreased by the elapsing time of oocyte ageing in common carp (Cyprinus Carpio). A significant decrease in embryo survival rate at 1 HPS was observed in grass carp (Ctenopharyngodon idella). The specific histone acetylation on H3K9, H4K5 and H4K8 didn't exhibit significant differences in different aged oocytes of common carp and grass carp. However, the histone H3K14ac and H4K16ac didn't show a signal either in fresh or aged oocytes in common carp and grass carp. The H4K12ac increased significantly at 28 HPS in common carp while decreased significantly at 1 and 4 HPS in grass carp. The histone acetyltransferase (HAT) activity showed an increasing trend during in vivo and in vitro oocyte ageing in common carp. The HAT activity increased significantly at 30 HPS in grass carp. The observed histone acetylation marks are reported to be species-specific and oocyte stage dependant. Therefore, the obtained results are the first to report the presence of H3K9ac, H4K5ac, H4K8ac, and H4K12ac, as well as the absence of H3K14ac and H4K16ac in common carp and grass carp metaphase II oocytes. Additionally, our findings suggest the possibility of developing an epigenetic marker for egg quality associated with fish oocyte ageing.

Abstract:

tostí spojených s procesem stárnutím oocytů. Výzkum prezentovaný v této práci navíc naznačuje možnost potencionálně vyvinout prakticky využitelný epigenetický ukazatel kvality oocytů, který by byl schopný zhodnotit kvylitu oocytů v průběhu jejich inkubace a stárnutí před jejich oplozením.

Keywords

kvalita oocytů, epigenetika, histonová acetylace, histonacetyltransferáza, ploidní anomálie, postovulační stárnutí

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 3. 2022

Thesis defence

• Supervisor: MSc. Azin Mohagheghi Samarin, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery