Epigenetic regulation of expression in plant transgenes

Mgr. Jana Lunerová Bedřichová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Tato práce byla zaměřena na studium epigenetických interakcí a epigenetické dědičnosti transgenních lokusů tabáku Nicotiana tobacum, které komunikují na úrovni posttranskripčního umlčení (angl. posttranscriptional gene silencing, PTGS). V experimentech byly použity dva transgenní lokusy. Lokus 1 je uspořádán jako obrácená repetice a díky této struktuře je schopen produkovat poměrně silný RNA signál, který způsobuje metylaci DNA de novo jak ve své sekvenci, tak i v sekvenci jemu homologní a vede k umlčení genové exprese. Druhý lokus 2 má podobu jedné kopie transgenu a je k lokusu 1 homologní. Hybridní jedinec obsahující oba lokusy je v lokusu 1 silně metylován ve všech motivech a podél celé sekvence, zatímco lokus 2 má v kódující oblasti reporterového genu nptII (neomycinfosfotransferáza) převážně metylaci typu CG. Asymetrická metylace je omezena pouze na 3´UTR oblast. Tento hybridní stav vede ke kompletní represi genové exprese nptII genu a oba transgeny se jeví jako umlčené. Po odsegregování lokusu 1 z hybrida došlo v potomstvu k téměř mendelistické dědičnosti metylace typu CG v kódující oblasti genu nptII. V první generaci segregantů byl dokonce pozorován nárust CG metylace v některých sekvencích. Tento metylační obraz se s mírnými odchylkami předával na potomstvo a byl stabilní po tři analyzované generace. Analýza malých RNA odvozených od T-DNA neprokázala přítomnost metylaci – indukujících siRNA v žádné generaci segregantů, což znamená, že tento metylační obraz je meioticky stabilní a může se dědit z generace na generaci bez přítomnosti RNA signálu. Exprese genu nptII byla v případě této epialelické varianty lokusu 2 v sesgregantech ihned obnovena, což ukazuje, že i poměrně vysoká hustota metylace typu CG (60-80%) v kódující oblasti (>600bp) nijak neblokuje genovou expresi. Stabilita dědičnosti metylace typu CG v genu nebyla ovlivněna ani genomickým stresem v tkáňové kultuře. Tato zjištění vedla k hypotéze, že v některých případech se může přítomnost CG metylace v euchromatinových genových oblastech vyskytovat jako pozůstatek pradávného PTGS procesu v historii genomu.

Abstract:

This work is focused on epigentic processes associated with posttranscriptional silencing of Nicotina tobacum transgenes and their trans-generation inheritance. In these experiments, two transgenic loci were used: locus 1 arranged as an inverted repeat transgene producing a strong RNA signal for de novo methylation and posttranscriptional gene silencing (PTGS) of a reporter gene encoding a bacterial neomycin phosphotransferase II (nptII). The second locus 2 is a naive single copy target locus with a 100% homology to locus 1. In a hybrid Lo1/Lo2 (combining both loci), the coding region of the target locus 2, a reporter nptII gene is methylated exclusively at CG dinucleotides, while non-CG methylation is located in the 3´untranslated region. Locus 1 is heavily methylated along the whole transcribed region and downstream sequence in both CG and non-CG motifs. Such hybrid plant is completely silenced with negligible expression activity. After segregating away the silencing locus 1 from hybrid, the inheritance of locus 2 DNA methylation was analyzed. The segregated progeny inherited CG methylation in the nptII coding region. In the first generation of segregants even an increase of CG methylation was observed in the target genes. This pattern was inherited with some variations over three generations at least and no T-DNA-derived small RNA fraction was detectable suggesting that during meiosis the CG methylation pattern is not erased and additionally may be inherited over generations without presence of any RNA signal. The expression of the reporter nptII gene in this epiallelic variants of locus 2 was immediately restored pointing out that relatively dense CG methylation (60-80%) imprinted on most of the coding region (>600bp) did not reduce gene expression. Stability of DNA methylation inheritance was not affected even by stress during callus culture cultivation. This observation led to the hypothesis that the genic CG methylation detected in euchromatic regions of the genome may represents remnants of an ancienit PTGS process in a genome history.

Keywords

transgenes, rostlinné transgeny, Nicotiana, tobacco, epigenetics, trans-generation inheritance, transgenerační dědičnost, metylace DNA, small RNA molecules, epialely, RNA-directed DNA methylation, transgenní tabák, plant transgenes, epigenetická dědičnost, post-transkripční umlčení genu, posttranscriptional gene silencing, RNA interference

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 8. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 19. 9. 2008
• Vedoucí: RNDr. Aleš Kovařík, CSc.
• Oponent: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc., Mgr. Hana Šimková, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie