Studium lokalizace cytokininového receptoru CRE1/AHK4 pomocí fluorescenčně značeného cytokininu

Mgr. Karolina KUBIASOVÁ

Doctoral thesis

Functional studies on cytokinin receptors and their localization using fluorescent labeling

Abstract:

Cytokinins are plant hormones that play an essential role in various aspects of plant growth and development. In Arabidopsis thaliana three transmembrane histidine kinases, namely AHK2, AHK3 and CRE1/AHK4, serve as cytokinin receptors. Subcellular localization of the receptors proposed the endoplasmic reticulum (ER) membrane as a principal cytokinin perception site, while the study of cytokinin transport pointed to the plasma membrane (PM)-mediated cytokinin signalling. To gain better insight into the dynamics of cytokinin receptor localization within the cell a series of cytokinin fluorescent probes were developed. The ligand properties of isopentenyladenine (iP)-derived probes were assessed in a bacterial receptor test where the competition of a cytokinin fluoroprobe with radiolabelled trans-zeatin was measured. Although the structural changes within the fluorescent probes led mostly to a significant loss of the biological activity, several fluorescent derivatives interacted well. The most promising of them (iP-NBD) was selected as a tool for visualization of the cytokinin receptor pool inside the cell. By detailed monitoring subcellular localizations of the fluorescently labelled natural cytokinin probe and the receptor ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 4 (CRE1/AHK4) fused to GFP reporter, it is shown that pools of the ER-located cytokinin receptors can enter the secretory pathway and reach the PM in cells of the root apical meristem, and the cell plate of dividing meristematic cells. A revised view on cytokinin signalling and the possibility of multiple sites of perception at PM and ER is provided.

Abstract:

Cytokininy jsou rostlinné hormony, které hrají důležitou roli v mnoha růstových a vývojových procesech rostlin. V Arabidopsis thaliana se nachází tři transmembránové histidin kinasy, které fungují jako cytokininové receptory, konkrétně AHK2, AHK3 a CRE1/AHK4. Výsledky subcelulární lokalizace receptorů navrhovaly endoplasmatické retikulum (ER) jakožto hlavní místo cytokininové percepce, zatímco studium cytokininového transportu ukazovalo na plasmatickou membránu (PM) jako místo cytokininové signalizace. Pro lepší pochopení dynamiky lokalizace cytokininových receptorů v buňce byla připravena řada fluorescenčních prób. Vlastnosti prób odvozených od isopentenyladeninu (iP) byly stanoveny v bakteriálním receptorovém testu, kde byla sledována kompetice mezi fluorescenčně značeným cytokininem a radioaktivně značeným trans-zeatinem. Přestože strukturní změny fluorescenční proby vedly většinou k výrazným ztrátam biologické aktivity, několik fluorescenčních derivátů se vázalo dobře. Jeden z nich (iP-NBD) byl vybrán jako nástroj pro vizualizaci cytokininových receptorů v buňce. Pomocí detailní studie subcelulární lokalizace fluorescenčně značeného cytokininu a ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 4 (CRE1/AHK4) receptoru sfuzovaného s GFP reporterem bylo ukázáno, že ER-lokalizované cytokininové receptory vstupují do sekreční dráhy až k PM v buňkách kořenového apikálního meristému a k buněčné desce dělících se meristematických buněk. Byl tak poskytnut upravený pohled na signalizaci cytokininů a možnost různých míst percepce na PM a ER.

Keywords

cytokininy, cytokininové receptory, CRE1/AHK4, histidin kinasy, fluorescenční značení, konfokální mikroskopie, percepce cytokininů, GFP, NBD, Arabidopsis thaliana, endoplasmatické retikulum, plasmatická membrána, brefeldin A

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 10. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry