Experimentální stanvení vazebných afinit fosfoproteinů vázaných do 14-3-3 proteinů důležitých pro neurobiochemii mozku

Mgr. Zuzana Trošanová, Ph.D.

Doctoral thesis

Experimental determination of binding affinities of phospoproteins towards 14-3-3s that are important in neurobiochemistry of the brain

Abstract:

Rodina 14-3-3 proteinů je nezbytná ve všech eukaryotických buňkách, kde 14-3-3 proteiny regulují aktivitu stovek klientských proteinů v závislosti na jejich fosforylaci. Jednotlivé izoformy se vyskytují jako monomery, homodimery nebo heterodimery s různou specifitou a funkcí. Funkční variabilita je dále rozšířena o biologicky relevantní fosforylaci S58 na rozhraní dimeru. Hlavním cílem této práce bylo studium monomer-dimerní rovnováhy 14-3-3zeta proteinu a vlivu fosforylace S58 na monomer-dimerní rovnováhu. Navrhli jsme testy pro stanovení biofyzikálních dimerizačních konstant Kd a koff pomocí jednoduchého experimentu s jednoduchou instrumentací, která je na rozdíl od náročných technik, jako je FCCS, mnohem dostupnější v laboratořích. V této práci jsou prezentována reprodukovatelná a kvantitativní data popisující homo- a heterodimerizaci mezi fosforylovanými S58 a WT formami 14-3-3zeta proteinu. Popsané in vitro testy jsou také přímo použitelné pro 14-3-3 izoformy z jakéhokoli eukaryotického organismu. Další studie byla zaměřena na srovnání dvou 14-3-3zeta proteinových klientů: MAP2c a tau proteinu. Poprvé byla pomocí mikroškálovej termoforézy charakterizována interakce 14-3-3zeta s fosforylovaným a nefosforylovaným proteinem MAP2c. Fosforylační místa PKA proteinu MAP2c byla určena pomocí NMR a hmotnostní spektrometrie. Naše výsledky ukázaly, že navzdory vysoce homologním sekvencím MAP2c a tau proteinu se afinitní vazebná místa fosforylovaných MAP2c a tau významně liší. Poslední projekt byl zaměřen na hydratační studii tzv. lone pair-pi interakcí mezi W48 Engrailed Homeodoménou a OH skupinou molekuly vody. V této studii jsme zkombinovali NMR data s molekulární dynamikou a MM/QM simulacemi.

Abstract:

The family of 14-3-3 proteins is essential in all eukaryotic cells where 14-3-3 proteins regulate the activity of hundreds of client proteins in phosphorylation dependent manner. The individual isoforms occur as monomers, homodimers, or heterodimers having different specificity and function. Their functional variability is further extended by the biologically relevant phosphorylation of S58 at the dimer interface. The main aim of this thesis was the study of monomer-dimer equilibria of 14-3-3zeta and the influence of the S58 phosphorylation on monomer-dimer equilibria. We designed assays for determination of the biophysical dimerization constants Kd and koff using a simple experiment with a single instrumentation, which, unlike demanding techniques such as FCCS, is much more available in laboratories. The reproducible and quantitative data describing the homo- and heterodimerization between phosphorylated S58 and WT forms of 14-3-3zeta are presented. The described in vitro assays are also directly applicable to 14-3-3 isoforms from any eukaryotic organism. The next study focused on comparing two 14-3-3zeta protein clients: MAP2c and tau protein. For the first time, the 14-3-3zeta interaction with phosphorylated and unphosphorylated MAP2c protein was characterized by microscale thermophoresis. The PKA phosphorylation sites of MAP2c protein were determined by NMR and mass spectrometry. Our results showed, that despite the highly homologous sequences of MAP2c an tau protein, the high-affinity binding sites for 14-3-3 protein of phosphorylated MAP2c and tau differ significantly. The last project presents the hydration study on lone-pair-pi interactions between W48 Engrailed Homeodomain and OH group of water molecule. In this study we combined NMR data with molecular dynamics and MM/QM simulations.

Keywords

protein, 14-3-3, Map2c, dimer, monomer, fluorescence, FRET, MST, fosforylace, phosphorylation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 27. 6. 2022
• Supervisor: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D., doc. Mgr. Daniel Jancura, PhD.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics