Studium vlivu intenzity ozáření v kombinaci se změnami teploty na strukturně-funkční vlastnosti pigment proteinových komplexů fotosystému II

Bc. Lenka NADKANSKÁ

Master's thesis

Study of irradiance influence in combination with changes of temperature on structural-functional properties of pigment-protein complexes of photosystem II

Abstract:

Tato diplomová práce se věnuje separaci pigment-proteinových komplexů (PPC) z thylakoidních buněčných membrán ječmene jarního pomocí nativní elektroforézy (CN-PAGE). Po změně vedoucího práce se hlavní náplní stala optimalizace metodiky CN-PAGE s cílem získat úzce rozdělené zóny separovaných PPC, oddělené dále od sebe a eliminovat nedostatky (jako rozmytí zón, ?smiling? efekt, systému chlazení lázně apod.) původně používané metodiky. Dalším bodem bylo tuto optimalizovanou metodiku podrobně sepsat a pomocí ní separovat PPC rostlin ječmene jarního pěstovaných pod vlivem různé ozářenosti (LI - 100, MI - 300 a HI -1000 ?mol m-2 s-1). Mnou navržená metodika CN-PAGE zahrnuje použití zaostřovacího gelu (4% akrylamidový gel - AA; pH=7), dělícího gelu o dvou koncentracích akrylamidu (5 a 8,5% AA; pH=8,3). Tyto dva dělící gely se od 4% gelu liší přítomností glycerolu. Místo detergentu Deriphat v horním elektrodovém pufru jsem použila kombinaci decylmaltosidu (DM) a deoxycholátu (DOC), který je šetrnějším detergentem. Zavedla jsem systém míchání dolního elektrodového pufru, upravila systém chlazení (pokles teplot na cca 5°C během separace). Navrhla jsem používat vysokonapěťový zdroj PS9009 TC (GibcoBRL,USA) a separaci provádět v režimu konstantního napětí. CN-PAGE analýzou bylo separováno 7 zón PPC a zóna odpovídající volným pigmentům. PPC byly seřazeny v gelu podle klesající velikosti komplexů následovně SC-z (MI a HI rostliny), SC, PSI, CCI, CCII, LHCIIt, LHCIIm a FP. Zóny byly relativně dobře odděleny od sebe (především se zcela podařilo od sebe rozdělit zónu LHCIIt a LHCIIm). Pomocí elektroeluce byly vymyty PPC z bandů gelu a stanoven obsah pigmentů pomocí následné HPLC analýzy. ?-karoten byl zjištěn ve větším množství v bandech obsahující jádra fotosystémů (SC-z, SC, PSI, CCI, CCII) a také v zóně volných pigmentů. Největší množství Chlb se nacházelo v trimerech a monomerech LHCII a také jako součást volných pigmentů. V bandu LHCIIt a LHCIIm byly také nejvíce zastoupeny Lu a Neo. Viola byl nejvíce zastoupen především ve FP bandu a v menší míře také v LHCIIm. Analýza vlivu doby uchování eluátu PPC na obsah pigmentů stanovených pomocí HPLC ukázala, že čtyřdenní uchování eluátu ve 100% acetonu v mrazničce při -18°C má zanedbatelný vliv na stanovované obsahy a poměry pigmentů. Uchovávání eluátu 11 a více dní vede k degradaci pigmentů (především chlorofylů) a nelze jej doporučit.

Abstract:

This thesis is aimed at the separation of pigment-protein complexes (PPC) by native electrophoresis (CN-PAGE) of isolated thylakoid membranes (tBM) from barley plants. Due to change of the thesis supervisor, the aim of the thesis was modified as - optimization of CN-PAGE to obtain narrow and individually separated bands of PPC and to eliminate disadvantages of the previous methodology (as washing zones, "smiling" effect, cooling of electrophoretic bath etc.). Then, new methodology specify as manual and use it for separation of PPC of barley plants grown under different irradiances (100 - LI, 300 - MI and 1000 ?mol m-2 s-1 ? HI plants). My modified CN-PAGE methodology includes using stacking gel (4% acrylamide gel - AA; pH=7), separating gel consisting of two AA concentrations (5 and 8,5% AA; pH=8,3). The two separating gels contain glycerol in comparison with stacking gel. I used the combination of two detergents - decylmaltoside (DM) and deoxycholate (DOC - mild ionic detergent) as for tBM solubilisation as addition to the upper electrode buffer instead of Deriphat detergent. I introduced the lower electrode buffer mixing, adjusted the cooling system for electrophoretic bath (temperature obtained during separation was about 5 °C). I suggested using a high voltage supply and separation to carry out in regime of constant voltage. Modified CN-PAGE methodology provided 7 zones of PPC as well as zone of free pigments. PPC were arranged in the gel according to their decreasing molecular weight of complexes as: SC-z (MI a HI plants), SC, PSI, CCI, CCII, LHCIIt, LHCIIm a FP. Bands were well separated from each other (especially bands corresponding to LHCIIt and LHCIIm were totally separated). Separated PPC were electroeluted from gel bands and eluate was used for estimation of pigment content by HPLC analysis. ?-caroten was found in higher amount in bands consisting photosystem I and II core (SC-z, SC, PSI, CCI, CCII) and also in bands of free pigments. The biggest amount of Chlb has been found in LHCIIt and LHCIIm and also in free pigment zone. In the bands of LHCIIt and LHCIIm were Lu and Neo the most evident. Viola was presented mainly in FP band and in smaller amount also in LHCIIm. The influence of time of storage of the eluted PPC on the pigment content estimated by HPLC was also studied and showed that four-day storage of the eluate in 100 % acetone at -18°C (in the freezer) has insignificant influence on pigment content and ratio. The storage of the PPC eluate for 11 or more days leads to the degradation of pigments (especially chlorophylls) and cannot be recommended for precise pigment estimation.

Keywords

CN-PAGE, pigment-proteinové komplexy, ječmen jarní, ozářenost, teplota, obsah pigmentů, elektroeluce, aklimace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 4. 2011

Accessible from:: 24. 4. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2011
• Supervisor: Mgr. Irena Kurasová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Applied Physics / Biophysics