Studium proteinu Rab-2A v kančích spermiích v souvislosti s jeho zona pellucida vázající aktivitou

Natálie Zelenková

Master's thesis

Study of Rab-2A protein in boar spermatozoa in connection with its zona pellucida binding activity

Abstract:

Protein Rab-2A patří do podskupiny Rab malých GTPáz nadrodiny Ras. Podobně jako ostatní Rab proteiny se Rab-2A účastní regulace intracelulárního membránového transportu na různých úrovních a je nezbytným proteinem pro transport molekul z endoplazmatického retikula do Golgiho komplexu. Protein Rab-2A byl lokalizován u mnoha druhů živočichů v nejrůznějších buňkách a tkáních, ve kterých zastává mnoho různých funkcí. V současnosti je věnována pozornost studiu Rab proteinů i v kontextu reprodukce. Protein Rab-2A byl stejně jako některé jiné Rab proteiny identifikován v savčích spermiích, jeho přesná role v těchto buňkách však zatím nebyla plně objasněna. V býčích spermatidách byl protein Rab-2A lokalizován v perinukleární théce a předpokládá se jeho zapojení do biogeneze akrozomu během spermiogeneze. V kančích spermiích byla popsána přítomnost Rab-2A na jejich povrchu spolu s vazebnou aktivitou k zona pellucida a uvažuje se o jeho možné roli ve vazbě na oocyt. Cílem této diplomové práce bylo detekovat a lokalizovat protein Rab-2A v kančích spermiích v různých stádiích jejich posttestikulárního vývoje. Dále byla studována vazba spermií na zona pellucida prasečího oocytu po blokaci proteinu Rab-2A pomocí protilátky. Pomocí metody Western blot jsme detekovali protein Rab-2A v lyzátu kančích spermií během jejich maturace. Protein Rab-2A se nám podařilo detekovat v proteinových extraktech epididymálních, ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií a v extraktu proteinů spermií po akrozomální reakci. Celkem jsme detekovali čtyři různé izoformy proteinu Rab-2A o molekulových hmotnostech 21, 24, 27 a 31 kDa. Imunodetekce rovněž odhalila dvě izoformy Rab-2A o molekulových hmotnostech 21 a 24 kDa v extraktu proteinů perinukleární théky ejakulovaných kančích spermií. Pomocí nepřímé fluorescenční mikroskopie jsme lokalizovali protein Rab-2A v epididymálních, ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermiích v oblasti akrozomu. Na spermiích po akrozomální reakci protein Rab-2A nebyl detekován. Vazebná aktivita proteinu Rab-2A k zona pellucida oocytu byla hodnocena po inkubaci spermií s protilátkou proti Rab-2A. Experiment odhalil, že vazba spermií na zona pellucida byla částečně zablokována. Z našich výsledků vyplývá, že protein Rab-2A je přítomen na kančích epididymálních, ejakulovaných a kapacitovaných spermiích v akrozomální oblasti hlavičky a rovněž se nachází v perinukleární théce. Role proteinu Rab-2A ve vazbě spermie na oocyt nebyla jednoznačně potvrzena, nicméně blokace proteinu protilátkou snížila počet spermií vázajících se na oocyt.

Abstract:

Rab-2A protein belongs to the Rab subgroup of small GTPases of the Ras superfamily. Like other Rab proteins, Rab-2A is involved in the regulation of intracellular membrane trafficking at various levels and is an essential protein for the transport of molecules from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex. Rab-2A protein has been found in number of animal species in many cells and tissues, in which it has several different functions. At present particular attention is paid to the study of Rab proteins in the context of reproduction. The Rab-2A protein, like some other Rab proteins, has been identified in mammalian spermatozoa, but its exact role in these cells has not yet been fully elucidated. In bovine spermatids, the Rab-2A protein was localized in the perinuclear theca and is thought to be involved in acrosome biogenesis during spermiogenesis. In boar sperm, the presence of Rab-2A on the sperm surface has been described. Moreover, it was shown that the protein coincides with zona pellucida binding and its possible role in sperm-oocyte binding has been suggested. The aim of this diploma thesis was to detect and localize the Rab-2A protein in boar sperm at different stages of their post-testicular development. Furthermore, the binding of sperm to the zona pellucida of porcine oocyte after blocking the Rab-2A protein with its antibody was studied. Using Western blot, we detected Rab-2A protein in boar sperm lysate during maturation. Rab-2A protein was detected in protein extracts of epididymal, ejaculated, in vitro capacitated, and acrosome-reacted sperm. In total, we were able to detect four different isoforms of Rab 2A protein with molecular weights of 21, 24, 27, and 31 kDa. Two Rab-2A isoforms of 21 and 24 kDa were also detected in proteins extracted from the perinuclear theca of ejaculated boar sperm. Using indirect immunofluorescence microscopy, we localized Rab-2A protein in the acrosome region of epididymal, ejaculated, and in vitro capacitated spermatozoa. Rab-2A protein was not detected in sperm after the acrosomal reaction. The binding activity of Rab-2A protein to the zona pellucida of the oocyte was evaluated after incubation of sperm with the anti-Rab-2A antibody. The experiment revealed that sperm binding to the zona pellucida was partially blocked. Our results indicate that the Rab-2A protein is localized in boar epididymal, ejaculated, and capacitated sperm in the acrosome region of the sperm head and is also found in the perinuclear theca. The role of Rab-2A protein in sperm-oocyte binding was not unequivocally confirmed, however, blocking the protein with its antibody reduced the number of oocyte-bound sperm.

Keywords

imunofluorescence, Western blot, vazebná studie, kapacitace, protilátka

Keywords

binding assay, antibody, capacitation, Western blot, immunofluorescence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology