Proteiny odpovědné za špatnou prognózu lokalizovaných nádorů ledvin

Bc. Richard Štefaník

Master's thesis

Proteins responsible for poor prognosis of localized renal cell carcinomas

Abstract:

Karcinom ledvin je jedním z nejčastěji diagnostikovaných karcinomů na světě. Česká republika je na 2. místě v celé Evropě v mezinárodním srovnání výskytu tohoto karcinomu. Lokalizovaný karcinom ledvin je obvykle léčen za pomocí chirurgického zákroku, kdy dojde k odstranění primárního nádoru, což však nevylučuje riziko relapsu. Doposud nebyl nalezen žádný proteinový prognostický marker, který by mohl identifikovat pacienty s rizikem re-lapsu. Cílem této práce bylo na základě proteomové analýzy identifikovat potenciální pro-gnostický marker, který by identifikoval pacienty s vyššími rizikem relapsu lokalizovaného karcinomu ledvin. Proteomová analýza 43 primárních nádorů od pacientů, kteří relabovali do 5 let od diagnózy, párovaných se 43 tkáněmi primárních nádorů od pacientů bez relapsu odhalila jako možný marker protein PLOD2. Pomocí metody CRISPR/Cas9 byly z buněčné linie 786-0, odvozené z renálního karcinomu, připraveny klony s umlčeným genem PLOD2. Buňky 786-0 byly úspěšně transfekovány plazmidem pLenti CRISPR v2 s antiPLOD2 gRNA a selektovány pomocí antibiotika puromycin. Celkem bylo vyprodukováno 66 klonů, u nichž byla následně stanovena hladina proteinu PLOD2 pomocí SDS-PAGE a imunoblotingu. 9 klonů neprodukovalo protein PLOD2 a byla u nich provedena sekvenace lokusu PLOD2. U 3 klonů byla identifikována změna DNA typu inzerce/delece, kdy došlo k frameshiftu a vne-sení stop kodonu. Z těchto 3 klonů se podařilo 2 úspěšně kultivovat a byl u nich následně testován migrační potenciál metodou „scratch assay“ v porovnání s rodičovskou linií 786-0. Oba klony vykazovaly ve „scratch assay“ signifikantně sníženou schopnost migrace v po-rovnání s rodičovskou linií ve třech nezávislých experimentech. Celkově lze shrnout, že hla-dina PLOD2 souvisí na studovaném souboru s relapsem a migrační kapacitou nádorových buněk. Použité moderní přístupy bioinformatiky, molekulární a buněčné biologie nacházejí uplatnění v široké škále biomedicínských a biotechnologických procesů.

Abstract:

Renal cell carcinoma (RCC) is one of the most commonly diagnosed carcinomas in the world. The Czech Republic ranks the second in Europe in an international comparison of RCC incidence. Localized RCC is usually treated with surgery to remove the primary tu-mor which, however, does not eliminate the risk of relapse. To date, no protein prognostic marker has been revealed that could identify patients at risk for relapse. The aim of this thesis was to identify a potential prognostic marker based on proteomic analysis that could predict the recurrence of localized renal carcinoma. Proteomic analysis of 43 pri-mary tumors from patients who relapsed within 5 years of diagnosis, paired with 43 pri-mary tumor tissues from patients without relapse, revealed the PLOD2 protein as a possi-ble marker. Clones with the knock-outed PLOD2 gene were prepared from the renal carci-noma cell line 786-0 using the CRISPR / Cas9 method. 786-0 cells were successfully trans-fected with pLenti CRISPR v2 plasmid carrying antiPLOD2 gRNA and selected using puro-mycin. A total of 66 clones were produced, which were subsequently assayed for PLOD2 protein levels by immunoblotting. 9 clones that did not produce PLOD2 protein were se-quenced at PLOD2 locus. In 3 clones, a DNA change of the insertion / deletion type was identified, and a frameshift and introduction of the stop codon was confirmed. Of these 3 clones, 2 were successfully cultured and subsequently tested for migration capacity by the "scratch assay" method in comparison with the parental line 786-0. Both clones showed a significantly reduced ability to migrate in the scratch assay compared to the parental line. Overall, PLOD2 levels are related to RCC relapse in the studies set of patients and con-nected to migration capacity of RCC cells. The modern approaches of bioinformatics, mo-lecular and cell biology used in the thesis have a great potential in a wide range of biomed-ical and biotechnological processes.

Keywords

Karcinom ledvin, PLOD2, CRISPR/Cas9, světlobuněčný karcinom ledvin, migrace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2022
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Petr Beneš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biotechnology / Biotechnology