Regulace exprese vybraných virových a lidských genů účastnících se signálních drah řízených proteinem p53 v nádorových buňkách

Mgr. Pavla Hublarová, Ph.D.

Doctoral thesis

Regulation of expression of selected viral and human gene participating in signal pathways controlled by p53 protein in cancer cells

Abstract:

Metylace DNA je jedním z klíčových regulačních mechanismů exprese genů, nemění genovou sekvenci, pouze modifikuje strukturu DNA v nukleoproteinovém komplexu a její přístupnost pro transkripční faktory. Metylace DNA se nejčastěji uplatňuje na pozici C5 pyridiminového kruhu cytosinu v sekvenci CpG dinukleotidu, kam se pomocí DNA metyltransferáz váže skupina –CH3, dochází k dlouhodobému umlčení transkripce genu včetně přenosu tohoto stavu do další generace při buněčném dělení. Tato práce se zabývá studiem metylačního stavu DNA i) v promotoru a genu E6 v genomové DNA lidského papillomaviru 16 (HPV16) ve stěrech děložního hrdla a ii) v promotoru lidského genu RING finger protein 20 (RNF20) ve zdravé a nádorové tkáni prsu. HPV16 je nejčastější příčinou vzniku karcinomu děložního hrdla. Na transformaci keratinocytů se podílejí rané virové proteiny E6 a E7, E6 umožňuje specifickou degradaci proteinu p53. Ve studii byla stanovena pomocí PCR incidence HPV16, poté pomocí metylačně specifického štěpení endonukleázou McrBC určen stav promotoru a genu E6 HPV16 u klinických vzorků různých patologických stádií děložního hrdla a vyhodnoceno, zda metylační stav koreluje s průběhem onemocnění. Prokázali jsme, že frekvence výskytu HPV16 vzrůstá se závažností léze děložního hrdla a zastoupení metylací v promotoru a genu E6 HPV16 naopak během kancerogeneze klesá, přičemž statisticky významně nepřímo úměrně koreluje se závažností onemocnění. Stanovení metylace lze využít jako nádorový biomarker při určování rizik kancerogeneze pro jednotlivé pacientky. RNF20 je ubikvitin ligáza rodiny E3, která specificky monoubikvitinuje histon 2B a podílí se i na regulaci exprese proteinu p53. Metylační stav promotoru genu RNF20 jsme stanovovali pomocí bisulfitové modifikace ve zdravé a nádorové tkáni prsu, s cílem určit, zda se metylace uplatňuje ve vývoji nádoru mléčné žlázy. Byla prokázána statisticky významná změna stavu metylace DNA u promotoru genu RNF20 v nádorové tkáni prsu oproti okolní zdravé tkáni, což podporuje hypotézu o nádorově supresorových vlastnostech RNF20 v prsní tkáni.

Abstract:

DNA methylation is one of the key regulatory mechanism of gene expression. It does not change sequence of the gene, but is responsible for modification of DNA structure in nucleoprotein complex and accessibility of DNA for transcription factors. DNA methylation is most frequently located in C5 position of pyridimin ring of cytosin in dinucleotide CpG, where –CH3 group is bound by catalysis of DNA methyltransferases. This covalent modification leads to long term silence of gene transcription including transfer of methylation pattern into next generation of cells. This work is focused on study of DNA methylation state in (i) E6 promoter and gene of Human Papillomavirus 16 (HPV16) genome in cervical scrapes and (ii) human gene RING Finger Protein 20 (RNF20) promoter in tumour and normal breast tissue. HPV16 is responsible for development of majority of cervical tumours. The E6 and E7 early viral proteins cooperate during transformation of keratinocytes, E6 allows specific degradation of p53 protein. HPV16 was detected by PCR analysis in clinical samples of different cervical pathological states followed by analysis of the DNA methylation in E6 promoter and gene of HPV16 positive samples using methylation specific digestion by McrBC endonuclease. Obtained data were correlated with diagnosis and course of disease and statistically assessed. The incidence of HPV16 increased with clinical relevance of cervical lesions as well as that methylation of HPV16 E6 promoter and gene decreased during cancerogenesis. Frequence of methylation inversely proportionally correlated with the state of disease with statistic significance. Determination of methylation can be used as a tumour biomarker to find individual personal risk of tumour development. RNF20 is ubiquitin ligase family E3, who specifically monoubiquitines histon 2B and partly regulates expression of p53 protein. We analysed the methylation state of RNF20 promoter by bisulphite modification in normal and tumour breast tissue with aim to determine changes in RNF20 promoter methylation in development of breast cancer. We documented statistically significant change in methylation state of RNF20 promoter in tumour vs normal tissues of the breast. This finding supports hypothesis about tumour suppressor role of RNF20 in breast tissue.

Keywords

HPV16, gen E6, děložní hrdlo, promotory, metylace, RNF20

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 10. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 11. 3. 2010
• Supervisor: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology