Proteinové inženýrství lektinů – zapojení cíleně řízené mutageneze pro konstrukci nových proteinů

Bc. Eva Dejmková

Diplomová práce

Protein engineering of lectins -site directed mutagenesis of lectins from pathogens

Anotace:

Lektiny jsou proteiny vázající specificky, reverzibilně a nekovalentně sacharidy. Interakce lektin - sacharid hraje důležitou roli v buněčných rozpoznávacích procesech. V případě bakteriálních lektinů hrají klíčovou úlohu v rozpoznávání sacharidových struktur na povrchu hostitelských buněk a tím umožňují jejich adhezi, která je prvním krokem v rozvoji infekce. Potenciální využití antiadhezivních terapeutik nabývá v souvislosti se vznikem patogenních kmenů rezistentních k antibiotikům stále většího významu. Chromobacterium violaceum je podmíněný patogen, který může u lidí způsobovat závažné infekce, které můžou u imunodeficientních pacientů nebo u dětí končit fatálně. Vysoká úmrtnost u těchto jedinců může být způsobena neobvyklou rezistencí bakterie k antibiotikům. Bakterie produkuje lektin CV-IIL, který s vysokou afinitou specificky rozpoznává monosacharidy L-fukosu a D-mannosu. Příprava mutantních forem lektinů pomocí cíleně řízené metagenese může pomoci objasnit vazebné vlastnosti lektinů.

Abstract:

Bacterial lectins play a crucial role in the processes of recognizing saccharide moieties on the surfaces of host cells and therefore enabling adhesion of the bacteria, a first step in the process of infection. The potential use of antiadhesion therapy is still more and more interesting in regard to the emergence of new, antibiotics-resistent strains of bacteria. Investigation of the lectin-saccharide interaction by preparing mutants by site-directed mutagenesis and studying the related changes can greatly help in understanding of the principles that drive the important recognition processes. The CV-IIL lectin from the pathogenic microorganism Chromobacterium violaceum is a tetramer, the basic functional unit is a dimer. The lectin is able to specifically bind L-fucose and D-mannose with high afinity. The objective of this work was creating a recombinant protein with oligohistidin anchor at the N-terminal part (CV-IIL_8xHis), by using the method of site-directed mutagenesis. Following the preparation of the gene, the expression of the protein in (E.coli) expression system was optimized. The next step was an optimization of protein purification by metalloaffinity chromatography, using the interaction of histidins in the oligohistidin anchor with the metalloaffinity sorbents. In this case, there is no involvement of the lectin saccharide-binding sites in the purification - unlike the affinity chromatography approach that is based on the lectin-saccharide interaction, where the saccharide is immobilized in the column.

Klíčová slova

Lektiny, Chromobacterium violaceum, CV-IIL, proteinové inženýrství, cíleně řízená mutagenese Lectins, Protein engineering, Site directed mutagenesis

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 4. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2008
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie