Optimalizace procesu výroby inseminačních dávek pro účel umělé inseminace ovcí

Bc. Hana Beranová

Master's thesis

Optimization of the procedure for the production of insemination doses for the purpose of artificial insemination of sheep

Abstract:

Cílem diplomové práce je analýza mass motility neboli vířivého pohybu spermatu berana Valašské ovce a následně jeho ovlivnění přidanými ředidly. Je třeba optimalizovat ředění, abychom uchovali vířivý pohyb i při teplotě 38 °C, což je teplota děložního hrdla ovce během inseminace. Zachováním dobrého vířivého pohybu při této teplotě by mohlo dojít k prodloužení přežitelnosti spermií v reprodukčním traktu samice a následnému zvýšení šance na oplození. Sperma bylo odebráno od dvou samců plemene Valašská ovce. Ejakulát byl vždy odebrán od obou beranů. Ejakulát je velmi citlivý na teplotní šoky a proto je při manipulaci s ním důležité mít vše nahřáté na teplotu 37 – 38 stupňů Celsia. Jako první byl určen vstupní vířivý pohyb obou vzorků. Na předem vyhřáté podložní sklíčko byla nanesena kapka nativního spermatu a pod mikroskopem s přiblížením 40 x až 100 x, byl určen vířivý pohyb. Hodnocení je na škále od 0 do 5, kdy 5 je bráno jako nejkvalitnější. Za kvalitní vzorek se považuje od vířivého pohybu 3 a vyšší. Následně byly oba vzorky naředěny pěti ředidly v poměru 1:2, kdy celkový objem tvořil 180 mikrolitrů. Použita byla ředidla PBS, UHT mléko 3,5 %, Inra96, Optixcell, Diluent K, který byl poté nahrazen ředidlem SLAD. INRA 96, Optixcell, PBS a SLAD jsou komerční ředidla narozdíl od mléka 3,5% UHT a Diluentu K. Diluent K je vždy nutné připravit předem v laboratoři. Složení Diluentu K je 0,8 g glukózy, 2,9 g citronanu sodného, 20 ml vaječného žloutku a 100 ml destilované vody. Vždy byla ředidla předem nahřátá na teplotu 38 stupňů Ceslsia. U každého z beranů byla ponechána i varianta nenaředěného ejakulátu. Inseminační dávky byly následně analyzovány a hodnoceny po dobu 6 hodin ve 30 minutových intervalech. Výjimkou byl vzorek nenaředěného ejakulátu, který jsem hodnotila každou hodinu. Vždy po zhodnocení vířivého pohybu byly vzorky uloženy do vodní lázně s optimální teplotou 37 – 38 °C Z nasbíraných dat vyplývá, že vybraná ředidla mají různé vlivy a znatelně ovlivňují vířivý pohyb spermií. Překvapením bylo zjištění, že v některých případech jsou reakce na ředidla odlišná v závislosti na samci. To dokazuje, že pozitivní vliv na motilitu daného ředidla nelze se stoprocentní jistotou určit plošně na celou populaci Valašské ovce. Do budoucna by bylo vhodné ověřit kvalitu inseminačních dávek v in vivo podmínkách a zhodnotit míru plodnosti.

Abstract:

The aim of the thesis is to analyse the mass motility or the vortex movement of the semen of the Wallachian ram and its subsequent influence by added diluents. It is necessary to optimize the dilution in order to preserve the swirling motion even at 38 °C, which is the temperature of the sheep's cervix during insemination. By maintaining good vortex motion at this temperature, sperm survival in the reproductive tract of the female could be prolonged and the chance of fertilisation increased. Semen was collected from two male Wallachian sheep. The ejaculate was always collected from both rams. Ejaculate is very sensitive to temperature shocks and therefore it is important to keep everything warmed up to a temperature of 37-38 degrees Celsius when handling it. The first step was to determine the initial swirling motion of both samples. A drop of native semen was applied to a pre-heated slide and under a microscope with a magnification of 40 x to 100 x, the swirling motion was determined. The rating is on a scale of 0 to 5, with 5 being taken as the best quality. A swirling motion of 3 or higher is considered to be a quality sample. Subsequently, both samples were diluted with five diluents in a 1:2 ratio, with a total volume of 180 microliters. The diluents used were PBS, UHT milk 3.5%, Inra96, Optixcell, Diluent K, which was then replaced by SLAD. INRA96, Optixcell, PBS and SLAD are commercial diluents unlike 3.5% UHT milk and Diluent K. Diluent K must always be prepared in advance in the laboratory. The composition of Diluent K is 0.8 g glucose, 2.9 g sodium citrate, 20 ml egg yolk and 100 ml distilled water. The diluents were always preheated to a temperature of 38 degrees Cesslsius. A variant of undiluted ejaculate was also retained for each of the rams. The insemination batches were then analyzed and evaluated for 6 hours at 30 minute intervals. The exception was the undiluted ejaculate sample, which was evaluated every hour. Each time, after evaluation of the vortex motion, the samples were placed in a water bath with an optimal temperature of 37-38 °C The data collected showed that the selected diluents have different effects and noticeably influence the swirling motion of spermatozoa. It was surprising to find that in some cases the responses to diluents differed depending on the male. This shows that the positive effect on motility of a given diluent cannot be determined with 100% certainty over the whole population of Wallachian sheep. In the future, it would be useful to verify the quality of insemination doses under in vivo conditions and to assess the fertility rate.

Keywords

inseminace, ID, ovine, CASA, průtoková cytometrie, přežitelnost, analýza vířivého pohybu

Keywords

insemination, ID, ovine, CASA, flow cytometry, survival, mass motility

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 21. 5. 2024
• Supervisor: Ing. Filipp Georgijevič Savvulidi, Ph.D.
• Reader: Jakub Vozaf, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology