Příprava plasmidových konstruktů pro studium lokalizace kukuřičných cytokinindehydrogenas

Patricie JOHNOVÁ

Bachelor's thesis

Preparing of plasmid constructs for localization study of maize cytokinin dehydrogenases

Abstract:

Cytokinindehydrogenasy (CKX) jsou enzymy, které katalyzují ireverzibilní degradaci rostlinných hormonů cytokininů a hrají důležitou roli v regulaci jejich hladiny. V rostlinách jsou CKX proteiny kódovány malými genovými rodinami s různým počtem členů: 7 AtCKX genů bylo objeveno v Arabidopsis thaliana, 13 ZmCKX v kukuřici a 11 OsCKX v rýži. Jednotlivé isoformy CKX se liší v biochemických vlastnostech, úrovní exprese a také subcelulární lokalizací. Bylo zjištěno, že právě rozdílná subcelulární lokalizace CKX má významný dopad na fenotyp transgenních rostlin overexprimujících zmíněné isoformy. Subcelulární lokalizace CKX a různá hladina cytokininů v jednotlivých buněčných kompartmentech tedy zřejmě hraje důležitou roli při vývoji a růstu rostlin. Přítomnost signálního peptidu na N-terminálním konci značí sekreci CKX do apoplastu, vakuol nebo jiných buněčných organel. Naopak jeho nepřítomnost určuje lokalizaci proteinu v cytosolu.V Arabidopsis byla analýzou pomocí CKX-GFP fúzních proteinů zjištěna apoplastická lokalizace AtCKX2,4 a 6, cytosolární AtCKX7 a sekrece dvou isoforem do vakuol (AtCKX1 a 3). Naproti tomu z kukuřičných CKX byla doposud provedena charakterizace pouze ZmCKX1, sekretované do apoplastu a nesekretované ZmCKX10, lokalizované v cytosolu. Cílem této práce byla příprava plasmidových konstruktů obsahující vybrané ZmCKX-GFP fúzní geny (C-terminální fúze), které budou dále použity na studium jejich buněčné lokalizace. Prvním krokem byla PCR amplifikace 7 isoforem ZmCKX (3, 4a, 4b, 5, 8, 10 a 12). Po úspěšné amplifikaci a izolaci genů ZmCKX3 a ZmCKX5, byla provedena rekombinační BP reakce za účelem získání vstupních vektorů pDONR207:ZmCKX. Finální GFP expresní vektory pGWB5:ZmCKX byly připraveny rekombinační LR reakcí mezi destinačním vektorem pGWB5 a pDONR207:ZmCKX5, respektive dalšími již dříve připravenými vstupními vektory pENTR2B: ZmCKX1, ZmCKX2, ZmCKX6, ZmCKX8 a ZmCKX9. Sekvenční analýza potvrdila správnost všech zmíněných konstruktů a mohou být tedy použity pro studium lokalizace.

Abstract:

Cytokinin dehydrogenases (CKX) are enzymes catalyzing irreversible degradation of cytokinin phytohormones and play an important role in regulation of cytokinin level. In plants, CKX are encoded by small gene families with a varyring number of members: 7 AtCKX genes were found in Arabidopsis thaliana, 13 ZmCKX in maize and 11 OsCKX in rice. Indiviual CKX isoforms have different biochemical features, expression profiles and subcelullar localization. It was shown that distinct subcellular CKX localization has a strong impact on phenotype of CKX overexpressor transgenic plants. Distinct CKX localization as well as cytokinin level within respective cell compartments plays an important role in plant growth and development. Presence of the signal peptide at N-terminus indicate the secretion of CKX to apoplast, vacuole and or other cell compartments. On the other hand, lack of the signal peptide results in the CKX retention in the cytosol. Analysis of AtCKX-GFP fusion proteins from Arabidopsis revealed apoplastic localization of AtCKX2, 4 and 6; two of them were secreted to vacuole (AtCKX1 and 3), and one non-secreted AtCKX7 was targeted to the cytosol. On the other hand, there was only two ZmCKX characterized from maize: apoplastic ZmCKX1 and cytosolic ZmCKX10. The aim of this work was to prepare plasmid constructs carrying selected ZmCKX-GFP fusion genes (C-terminal fusion), which can be further used for study of its subcellular localization. The first step was PCR amplification of 7 ZmCKX isoforms (3, 4a, 4b, 5, 8, 10 and 12). Only two of them were successfully amplified (ZmCKX3 and ZmCKX5). After the isolation, the amplicons were used for BP recombination and thus entry clones pDONR207:ZmCKX were prepared. Final GFP expression clones pGWB5:ZmCKX were prepared by recombinant LR reaction using destination vector pGWB5 and pDONR207:ZmCKX5, and other previously prepared entry clones pENTR2B-ZmCKX1, ZmCKX2, ZmCKX6, ZmCKX8 and ZmCKX9. Accuracy of all discussed expression clones was confirmed by sequencing analysis, so that they can be used for localization study.

Keywords

Arabidopsis thaliana, cytokinin, CKX, kukuřice, subcelulární lokalizace, GFP.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2013

Accessible from:: 13. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2013
• Supervisor: Mgr. David Zalabák

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry