Úloha annexinu a cytoskeletu ve vývoji a stresových reakcích rostlin

Mgr. Michaela TICHÁ

Disertační práce

Role of annexin and cytoskeleton in plant development and stress responses

Abstract:

Annexins represent an evolutionarily highly conserved superfamily of proteins that have been identified in all eukaryotic organisms. In plants, this multifunctional group of proteins is involved in the coordination of essential biological processes such as differentiation, growth, and stress responses. It is well-known that annexins interact with cytoskeleton. The expression of annexins is regulated developmentally and is sensitive to the external environment. From eight members in Arabidopsis thaliana, the most abundant is ANNEXIN 1 (ANN1). One of the main aims of this Ph.D. thesis was the study of ANN1 and cytoskeleton roles during the development and stress responses of A. thaliana. For this purpose, highly advanced microscopy techniques were used, such as confocal laser scanning microscopy (CLSM), spinning disk confocal microscopy (SD), CLSM with Airyscan detector (AS), structured illumination microscopy (SIM) and several types of light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) platforms. The first part of the thesis, which focuses particularly on model plant A. thaliana and the crop Medicago sativa, summarizes the current knowledge on plant cytoskeleton, annexins, and basic principles of advanced microscopy methods used in this work. In the second part, we comprehensively studied developmental and stress-induced localization of GFP-tagged ANN1 in post-embryonic Arabidopsis organs by mentioned microscopy methods. In comparison with the conventional microscopy, LSFM allowed long-term imaging of ANN1-GFP in A. thaliana seedlings at near-physiological conditions without affecting plant viability. The following chapter deals with the verification of ann1 T-DNA insertional mutants for the future ANN1 gene functional studies, followed by phenotypic analysis of primary and lateral roots of these mutants. Due to current global environmental issues limiting yield of plants in agriculture, modern research urgently needs to focus not only on model plants but also usable crops, such as alfalfa. Visualization of plant cytoskeleton can help to better understand its functions and interconnection with annexins during development and stress responses on cellular and subcellular levels. The cytoskeleton represents a three-dimensional dynamic network of proteins that is involved in cell division and growth. These dynamic events need to be recorded in real time and space. The preparation of transgenic alfalfa lines expressing genetically-encoded cytoskeletal molecular markers and their subsequent visualization using advanced microscopic methods allow non-invasive studies on cytoskeleton in vivo. However, Abbe's diffraction-limited resolution of conventional fluorescence microscopy can constrain these observations. Better detection of fine cytoskeletal structures can be achieved by immunolabelling with antibodies and using modern super-resolution microscopy methods. Because of a robust structure of the alfalfa root, the precise immunolocalization of microtubules in root wholemounts is not an easy task. In this thesis, we present optimized immunofluorescence localization methods for microtubule visualization in fixed whole roots of alfalfa. The employment of super-resolution microscopy methods has allowed to overcome former limitation in the resolution. Here we describe two of these methods, namely SIM and AS. Both of them allow imaging of cortical microtubules at the super-resolution level, thus contributing to the current knowledge on plant growth, development and morphogenesis.

Abstract:

Anexíny predstavujú evolučne vysoko konzervovanú superrodinu proteínov, ktoré boli identifikované vo všetkých eukaryotických organizmoch. V rastlinách sa táto multifunkčná skupina proteínov podieľa na koordinácii základných biologických procesov, akými sú diferenciácia, rast a odpovede na stres. O anexínoch je známe, že interagujú s cytoskeletom. Expresia anexínov je regulovaná počas vývinu rastliny a je citlivá na vonkajšie prostredie. Z ôsmich členov v Arabidopsis thaliana je najviac abundantný ANEXÍN 1 (ANN1). Jedným z hlavných cieľov tejto dizertačnej práce bolo štúdium úloh ANN1 a cytoskeletu počas vývinu a stresových reakcií rastliny Arabidopsis thaliana. Pre tieto účely boli využité pokročilé mikroskopické techniky, ako je konfokálna laserová skenovacia mikroskopia (CLSM), konfokálna mikroskopia s rotujúcim diskom (SD), CLSM s Airyscan detektorom (AS), štruktúrovaná iluminačná mikroskopia (SIM) a niekoľko typov "light-sheet" fluorescenčnej mikroskopie (LSFM). Prvá časť práce, ktorá je zameraná najmä na modelovú rastlinu A. thaliana a plodinu Medicago sativa, sumarizuje súčasný prehľad poznatkov o anexínoch, rastlinnom cytoskelete, a základných princípoch pokročilých mikroskopických metód používaných v tejto práci. V druhej časti je komplexne popísané štúdium lokalizácie ANN1 proteínu značeného s GFP (ANN1-GFP) v post-embryonálnych orgánoch Arabidopsis počas vývinu a taktiež jeho relokalizácia v podmienkach stresu pomocou uvedených mikroskopických metód. V porovnaní s konvenčnou mikroskopiou, LSFM umožnila dlhodobé regulované snímanie ANN1-GFP v klíčencoch Arabidopsis za takmer fyziologických podmienok, a to bez ovplyvnenia životaschopnosti rastlín. Nasledujúca kapitola sa zaoberá overovaním T-DNA inzerčných mutantov ann1 pre budúce funkčné štúdie ANN1 génu, a následne tiež fenotypovou analýzou primárnych a laterálnych koreňov. Vzhľadom na súčasné globálne environmentálne problémy limitujúce výnosy rastlín v poľnohospodárstve sa moderný výskum potrebuje nevyhnutne zameriavať nielen na modelové rastliny, ale hlavne na využiteľné plodiny, akou je napríklad lucerna. Optimálna vizualizácia cytoskeletu rastlín môže napomôcť k lepšiemu porozumeniu jeho fungovania a prepojenia s anexínmi počas vývinu a stresových reakcií na bunkovej a subcelulárnej úrovni. Cytoskelet predstavuje trojdimenzionálnu sieť proteínov, ktorá sa dynamicky mení a podieľa sa na organizovanom delení a raste buniek. Tieto dynamické procesy je potrebné zaznamenávať v reálnom čase a priestore. Píprava transgénnych linií lucerny exprimujúcich geneticky-kódované molekulárne markery cytoskeletu a ich následné pozorovanie pomocou pokročilých mikroskopických metód umožňujú neinvazívne štúdium cytoskeletu in vivo. Rozlišovacia schopnosť konvenčnej fluorescenčnej mikroskopie je však obmedzená Abbého difrakčným limitom, čo znižuje kvalitu týchto pozorovaní. Lepšiu detekciu jemných štruktúr cytoskeletu možno dosiahnuť prostredníctvom imunoznačenia protilátkami a s využitím moderných super-rezolučných mikroskopických metód. Z dôvodu robustnej štruktúry koreňa lucerny, imunolokalizácia mikrotubulov nie je jednoduchá. V tejto dizertačnej práci predkladáme optimalizované metódy imunofluorescenčnej lokalizácie mikrotubulov vo fixovaných bunkách koreňa lucerny. Sprístupnenie mikroskopických metód so super-rozlíšením umožnilo zdolať dovtedy neprekonateľnú rozlišovaciu bariéru. Medzi ne patrí SIM a AS, ktoré sú popísané v tejto práci. Obe platformy umožňujú zobrazovanie kortikálnych mikrotubulov na vysokej rozlišovacej úrovni, a ich využitie môže prispieť k súčasným poznatkom o raste, vývine a morfogenéze rastlín.

Keywords

Airyscan mikroskopia, ANEXÍN 1, Arabidopsis thaliana, bunkové delenie, CLSM, imunofluorescenčné značenie, lattice light-sheet fluorescenčná mikroskopia, light-sheet fluorescenčná mikroskopia, Medicago sativa, mikroskopia so štruktúrovaným osvetlením, mikrotubuly, aktín, plazmatická membrána, stresové odpovede, subcelulárna lokalizácia, vývin

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 10. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 12. 2020
• Vedoucí: Mgr. Olga Šamajová, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie