Studium markerů leukemických onemocnění

Mgr. David Potěšil, Ph.D.

Disertační práce

Study of leucemic diseases markers

Anotace:

Imatinib je tyrosinkinázový inhibitor (TKI), který byl jako první cíleně vyvinut pro léčbu chronické myeloidní leukémie (CML). Jeho objevení přineslo zásadní změnu v úspěšnosti léčby CML. I přes to však existuje významná část pacientů, kteří na léčbu imatinibem neodpovídají optimálně, případně u nich léčba selhává úplně. V současné době se průběh terapie u konkrétního pacienta s CML. sleduje prostřednictvím tzv. reziduální nemoci. Hodnota a vývoj reziduální nemoci, nejčastěji během 1. roku léčby, se využívá jako prognostický marker dalšího vývoje a je také důvodem změny medikace. Imatinib a další TKI inhibují aktivitu fúzního BCR/ABL proteinu lokalizovaného v buněčné cytoplasmě. Intracelulární koncentrace léčiva je proto při léčbě CML klíčová. V této práci nás zajímalo, zda-li intracelulární koncentrace imatinibu, stanovená v rané fázi léčby, může posloužit jako prognostický marker dalšího vývoje léčby a urychlit tak přechod na efektivnější typ léčby. Na začátku byla optimalizována a částečně validována metoda stanovení imatinibu ve vzorcích buněk. Imatinib byl extrahován ze vzorku buněk a obsah imatinibu byl následně stanoven s použitím kapalinové chromatografie spojené s hmotnostním spektrometrem. K izolaci buněčného vzorku z periferní krve pacienta s CML byly testovány celkem 3 metody. Lyze erytrocytů se ukázala být nevhodnou kvůli významnému úniku intracelulárního imatinibu. Použití hustotního gradientu a zkumavek CPT Vacutainer poskytovalo srovnatelné hladiny intracelulárního imatinibu v izolovaných buňkách. Byly adresovány i další aspekty stanovení intracelulární imatinibu s cílem umožnit správnější výpočet a interpretaci intracelulární koncentrace léčiva (stanovení relativního zastoupení buněčných subtypů, výpočet individuální průměrné velikosti buňky aj.). Intracelulární koncentrace, společně s plasmatickou hladinou imatinibu byla následně sledována u skupiny 41 pacientů s CML v průběhu dvou let a byla dána do souvislosti s klinickými daty. U skupiny 26 vyhovujících pacientů byla pozorována korelace plasmatické a intracelulární koncentrace imatinibu. Naopak nebyl nalezen statisticky významný rozdíl v intracelulární koncentraci mezi skupinou selhávajících a neselhávajících pacientů. Prognostický potenciál intracelulární koncentrace imatinibu tak nebyl pozorován. Stanovení intracelulární koncentrace TKI bylo aplikováno i pro in vitro studii zabývající se pulzní léčbou pacientů s CML. Byla potvrzena přítomnost nezanedbatelného množství TKI v buňkách buněčné linie K562 vysvětlující srovnatelný účinek kontinuální a pulzní aplikace TKI.

Abstract:

Imatinib is tyrosinkinase inhibitor (TKI) which was developed for the therapy of patients with chronic myeloid leukemia (CML). It brought fundamental change into CML therapy course. However, there is still significant proportion of CML patients who reflect sub-optimal responses or fail Imatinib therapy. Nowadays the residual disease is monitored during the course of CML therapy. Residual disease value and progress during the first year of the therapy is used as prognostic marker of further development. Imatinib and other TKI inhibit activity of BCR/ABL fusion protein localized in cell cytoplasm. Therefore, intracellular drug concentration is crucial during CML treatment. In this work we were interested whether intracellular imatinib concentration, determined in early stage of CML therapy, could be used as prognostic marker of further treatment development. At the beginning, method for determination of intracellular imatinib was optimized and partially validated. Imatinib was extracted from cell sample and imatinib amount was further determined using liquid chromatography coupled with mass spectrometry detector. Three isolation procedures were tested to separate cell sample from peripheral blood sample of CML patients. Erythrocyte lysis was found to cause substantial leakage of intracellular imatinib. Utilization of density gradient and CPT Vacutainer tubes gave comparable levels of intracellular imatinib concentrations in isolated peripheral blood cells. There were also other aspects addressed during the method optimization to enable more accurate calculation and interpretation of drug intracellular concentration (e.g. analysis of relative percentage of cell subtypes, calculation of individual mean cell volume). Intracellular concentration together with imatinib concentration in plasma was monitored in 41 CML patients during two years. Correlation between plasmatic and intracellular imatinib concentration was found in a subgroup of 26 patients with acceptable clinical background. On the other hand, there was no statistically significant difference between intracellular imatinib concentrations in group of patients who failed imatinib therapy in comparison to patients whose acceptable response was observed. Determination of intracellular TKI concentration was used also in in vitro study of CML patients pulse treatment. Significant intracellular amount of TKI was confirmed inside K562 cell line which explained comparable effect of continual and pulse application of TKI.

Klíčová slova

analytická chemie, kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, imatinib, intracelulární koncentrace, chronická myeloidní leukémie, CML, management léčby, prognostický marker

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 19. 6. 2014
• Vedoucí: doc. Mgr. Jan Havliš, Dr.
• Oponent: Mgr. Miroslava Bittová, Ph.D., RNDr. Petr Novák, Ph.D., doc. RNDr. Petr Tarkowski, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie (čtyřleté) / Analytická chemie