Protizánětlivá aktivita mastných kyselin ze sardinek a šprotů

Bc. Martina Vysoudilová

Master's thesis

Anti-inflammatory activity of fatty acids of sardines and sprats

Abstract:

Řada potravin má pozitivní efekt na lidské zdraví. Mezi takové potraviny patří i mnozí vodní živočichové. Mezi ty se řadí také sardinky a šproty, které obsahují vysoké množství polynenasycených mastných kyselin, které mají vliv na lidské zdraví. Tyto mastné kyseliny mají schopnost zabraňovat vstupu virů do buněk a dále se replikovat. Současně mají vliv při řadě zánětlivých onemocnění, kdy jsou schopné inhibovat produkci zánětlivých markerů jako jsou oxid dusnatý (NO) a tumor nekrózní faktor (TNF). Cílem této práce bylo stanovit vliv sardinek a šprotů v rozdílné kulinární úpravě na produkci NO a TNF na buněčné linii myších makrofágů RAW264.7. Testovány byly sardinky a šproty bez tepelné úpravy, smažené, vařené, vařené v páře a pečené. Vzorky byly tráveny pomoci harmonizovaného statického modelu trávení INFOGEST 2.0, kdy postupně došlo k simulaci orální, gastrické a intestinální fáze trávení. Následně byly vzorky filtrovány přes PEF filtr o průměru 0,22 µm. Takto připravené vzorky byly pipetovány v koncentraci 20-0,009 % tráveniny do mikrotitrační destičky, kde byly již 1 h inkubovány buňky buněčné linie RAW 264.7. Současně byl do destičky přidán lipopolysacharid (LPS) v koncentraci 1 µg/ml s 24 h inkubací. Následně došlo k odebrání 50 µl supernatantu, který byl smíchán s 50 µl Griesova činidla s následným měřením při 540 nm. Byla stanovena produkce NO. Následně byla destička centrifugována, zbytek supernatantu odstraněn a zamražen pro další testy a nahrazen tetrazol bromidem a destička byla kultivována 2 h. Následně byl tetrazol bromid odstraněn a nahrazen dimethylsufoxidem a destička měřena při 495 nm. Byla stanovena koncentrace, kdy dochází maximálně k 5% úmrtí buněk. Zamražený supernatant byl využit pro stanovení TNF-α pomocí komerčního testu. Bylo zjištěno, že kromě smažených sardinek a šprotů mají testované vzorky toxický vliv na buňky až do koncentrace tráveniny 0,04 %. Smažené sardinky a šproty při vyšších koncentracích zvyšovaly produkci NO a jeho produkce byla vyšší i o 100 %. Při koncentraci tráveniny 0,04 % nebyl zaznamenám statisticky významný rozdíl v produkci NO v porovnání s kontrolou. U produkce TNF-α bylo pouze u syrové sardinky zaznamenáno 8% snížení produkce TNF. Většina tepelných úprav naopak vedla k výraznému zvýšení produkce TNF v porovnání s kontrolou. Tepelná úprava u vzorků byla smažení, vaření, vaření v páře a pečení. Můžeme říci, že hypotéza byla vyvrácena a mastné kyseliny z trávenin ryb mají negativní účinek na protizánětlivou aktivitu.

Abstract:

Many of foods have a positive effect on human health, including many aquatic animals. These also include sardines and sprats, which contain high amounts polyunsaturated fatty acids that affect human health. These fatty acids have the ability to prevent cells from entering of viruses and their replication further. They also have an effect on number of inflammatory diseases with ablility to inhibit production of inflammatory markers such as nitric oxide (NO) and tumour necrosis factor (TNF). The aim of this thesis was to determine the effect of sardines and sprat in different culinary treatment on the production of NO and TNF on the mouse macrophage cell line RAW264.7. Sardines and sprat were tested without heat treatment, fried, boiled, steamed and baked. These samples were digested using harmonized static digestion model INFOGEST 2.0, which gradually simulated the oral, gastric and intestinal phases of digestion. The samples were then filtered through a PEF filter with a diameter of 0.22 μm. Samples prepared this way were pipetted at a concentration of 20-0.009% chyme into a microtitre plate, where cells of RAW 264.7 cell line were incubated for 1 hour. At the same time, a 1 μg/ml lipopolisaccharide (LPS) was added to the plate with 24 h incubation. Subsequently, 50 μl of supernatant was collected and mixed with 50 μl of Gries' reagent followed by measurements at 540 nm. Subsequently, the plate was centrifuged, the rest of the supernatant was removed and frozen for further tests and replaced with tetrazol bromide and the plate was cultivated for 2 h. Subsequently, tetrazole bromide was removed and replaced with dimethylsufoxide and the plate measured at 495 nm. Concentration has been determined where maximally 5% of cell deaths occured. The frozen supernatant was used to determine TNF-α by a commercial test. Except for fried sardines and sprats, the tested samples were found to have a toxic effect on cells up to a concentration of chyme 0.04%. Fried samples of sardines and sprats increased NO production and its production was higher by 100%. At a concentration of 0.04%, there was no statistically significant difference in the production of NO in control treatment. TNF-α production showed an 8% reduction of TNF production in raw sardines. Conversely, most heat treatments have resulted in a significant increase in TNF production compared to controls. Heat treatment for the samples was frying, boiling, steaming and baking. We can say that the hypothesis has been refuted, and fattys acids of fish chyme have a negative effect on anti-inflammatory activity.

Keywords

Cyklooxygenása, interleukin, faktor nádorové nekrózy, lipopolysacharid, buněčné linie

Keywords

cyklooxygenase, interleukins, tumor necrosis factor, lipopolysacharide, cell lines

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 17. 5. 2023
• Supervisor: Ing. Ivo Doskočil, Ph.D.
• Reader: Ondřej Ženata, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food and Nutrition