Klonování a analýza signálních sekvencí transportéru ENT1 z Arabidopsis thaliana a jejich vlivu na subcelulární lokalizaci

Bc. Barbora ZPĚVÁKOVÁ

Master's thesis

Molecular cloning of Arabidopsis ENT1 transporter and functional characterization of its molecular targeting signals

Abstract:

Diplomová práce se zaměřuje na analýzu signálních sekvencí ekvilibrativního nukleosidového transportéru 1 u A. thaliana (AtENT1), jež je domnělým transportérem cytokininů. Cílem diplomové práce je blíže objasnit roli signálních sekvencí AtENT1, jeho subcelulární lokalizaci a transportní funkci. Pomocí klonovacích metod byl připraven expresní konstrukt ENT1 s GFP značkou vloženou na N-terminální smyčku proteinu tak, aby nedošlo k narušení predikované signální sekvence. Tímto konstruktem byly stabilně transformovány rostliny A. thaliana, ze kterých byla odvozena homozygotní ENT1-produkující linie. Pomocí konfokální laserové mikroskopie byla u této linie pozorována subcelulární lokalizace proteinu ENT1 a byla srovnána s dříve připravenými ENT-GFP liniemi, jež neposkytovaly uspokojivé výsledky. Fenotypizací ENT1-produkující linie byl prokázán její funkční fenotyp a nadměrná citlivost k cytokininovým ribosidům. Na závěr byla provedena místně-specifická mutageneze domnělé signální sekvence v N-terminální smyčce ENT1 s cílem potvrdit její roli v lokalizaci ENT1.

Abstract:

The diploma thesis focuses on the analysis of the signal sequences of equilibrative nucleoside transporter 1 in A. thaliana (AtENT1), which is a putative cytokinin transporter. The aim of this thesis is to further understand the role of AtENT1 signal sequences, its subcellular localization and transport function. Using cloning methods, an expression construct of ENT1 was prepared with a GFP tag inserted out of the predicted signal sequence to avoid its disruption. A. thaliana plants were transformed with this expression construct, from which a homozygous ENT1-producing line was derived. Using confocal laser scanning microscopy, the subcellular localization of the ENT1 protein was observed in this line and compared with previously prepared ENT-GFP lines, which did not provide convincing results. Phenotyping of the ENT1-producing line demonstrated its functional phenotype and hypersensitivity to cytokinin ribosides. Finally, site-directed mutagenesis of a putative signal sequence in the N-terminal loop of ENT1 was performed to confirm its role in ENT1 localization.

Keywords

Arabidopsis thaliana, cytokininy, transport cytokininů, ekvilibrativní nukleosidový transportér 1, ENT1

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2024

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology