Cytokinin dehydrogenase: heterologous expression, isozyme characteristics and analytical application

Ing. Mgr. Marta KOWALSKA

Doctoral thesis

Abstract:

Tato práce se zabývá enzymem cytokinin dehydrogenasa z Arabidopsis thaliana a je rozdělena do čtyř částí. První kapitola uvádí isoenzymy cytokinin dehydrogenasy, jejich strukturu, lokalizaci, vlastnosti a funkce. Druhá část této práce je zaměřena na purifikaci a charakterizaci nesekretovaných isoenzymů. Vakuolární proteiny AtCKX1 a AtCKX3 byly produkovány v kvasince Pichia pastoris a cytosolický enzym AtCKX7 byl získán v expresním systému E. coli. V případě AtCKX1 a AtCKX3 byla odhalena přítomnost N-terminálního sekvenčně-specifického signálu pro transport do vakuoly. Příslušné rekombinantní proteiny byly purifikovány za účelem biochemické charakterizace. Jejich identita byla potvrzena pomocí MALDI-TOF/MS a následně byly stanoveny jejich substrátové specifity a preference pro elektronové akceptory. Ve třetí části práce je popsána produkce apoplastického enzymu AtCKX2. Konstitutivní, extracelulární exprese AtCKX2 byla provedena v kvasinkách Pichia pastoris. Rekombinantní protein byl označen histidinovou kotvou následovně: na C-konci, na N-konci a na obou koncích za účelem usnadnění purifikace a byl určen vliv histidinových fúzi na enzymovou aktivitu. Dále byla zavedena exprese ve velkém měřítku, v 15-i litrovém fermentoru, s použitím glycerolu a glukózy, jako zdrojů uhlíku. V poslední kapitole je popsán vývoj cytokininového biosenzoru s využitím rekombinantního enzymu AtCKX2.

Abstract:

This work deals with cytokinin dehydrogenase enzymes from Arabidopsis thaliana and consists of four parts. The first chapter is an introduction to cytokinin dehydrogenase enzymes, their structure, localization, properties and functions. The second part of this work is focused on the purification and characterization of non-secreted AtCKX isozymes. Vacuolar proteins AtCKX1 and AtCKX3 were produced in Pichia pastoris and cytosolic enzyme AtCKX7 was obtained from Escherichia coli expression system. In the case of AtCKX1 and AtCKX3 the presence of N-terminal sequence-specific vacuolar sorting signal was revealed. Respective recombinant proteins were purified for their biochemical characterization. With the use of MALDI-TOF/MS the enzymes were identified and subsequently their substrate specificity and electron acceptor preference was determined. In the third part of the work the production of an apoplastic enzyme AtCKX2 is described. The constitutive extracellular expression of AtCKX2 was carried out in Pichia pastoris. Recombinant protein was fused with His-tag domain on its C-terminus, N-terminus and on both termini in order to facilitate purification and the influence of such fusions on enzyme?s activity was determined. Further, large-scale expression in 15 litres fermentor was established with glycerol and glucose as the carbon source. The last chapter describes the development of cytokinin biosensor with the use of recombinant AtCKX2 enzyme.

Keywords

Cytokinindehydrogenasa, Pichia pastoris, Exprese a purifikace proteinů, His-tag, Sekvenčně-specifický signál pro transport do vakuoly, Fermentor, Biosenzor

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 11. 2010

Accessible from:: 25. 11. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 25. 11. 2010
• Supervisor: Prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., PhD.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry