Analýza reaktivních forem kyslíku v rostlinných tkáních pomocí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescenční detekcí

Mgr. Jan Schejbal

Bachelor's thesis

Analysis of reactive oxygen species by means of CE with LIF detection

Abstract:

V této bakalářské práci se věnujeme reaktivním formám kyslíku (ROS) a to zejména jejich semikvantativnímu stanovení. Udržování fyziologické hladiny ROS v buňkách a také v organelách je zásadní pro vitalitu buňky i celého organismu. Současně jsou ROS významnou součástí řady signálních mechanismů. Proto jsou dnes ROS v centru pozornosti mnoha vědeckých skupin. My zde představujeme použití metody založené na kapilární elektroforéze ve spojení s velice citlivou laserem indukovanou fluorescenční detekcí (CE LIF), využívající fluorescenční sondy dichlorofluorescinu diacetátu (DCFH-DA) pro semikvantifikaci ROS v rostlinných tkáních, přesněji přímo v chloroplastech. DCFH-DA podstupuje v buňkách a organelách enzymatickou deacetylaci a následně je oxidována pomoci ROS na vysoce fluorescentní produkt dichlorofluorescein (DCF). Tento produkt je možné detekovat pomocí CE-LIF. V práci jsme postupovali následovně: izolované chloroplasty byly inkubovány s DCFH-DA za dvou různých světelných a teplotních podmínek. Změna hladiny ROS v chloroplastech odpovídající nastaveným podmínkám se projevila na množství DCF ve vzorku, které bylo detekováno. Výsledky měření byly standardizovány na množství chlorofylu a ve vzorku a podrobeny statistickému t-testu, který prokázal, že jsou signifikantní (p < 0,01). Tato metoda se může stát významným nástrojem ve snaze pochopit veškeré pochody a principy, na kterých se podílí ROS.

Abstract:

In this thesis we study reactive oxygen species (ROS) especially their semiquantitative measuring. Maintaining the physiological level of ROS in cells and also in organelles is essential for the cell vitality and the vitality of the whole organism, concurrently ROS play significant role in many signaling pathways. Therefore, ROS are in the centre of interest of many research groups. Here we present an application of a method based on capillary electrophoresis coupled with highly sensitive laser induced fluorescence detection (CE-LIF), using the dichlorofluorescin diacate (DCFH-DA) as the fluorescent probe for semiquantitative measuring of the ROS level in plant tissues, more precisely in chloroplasts themselves. The DCFH-DA undergoes enzymatic deacetylation in cells and organelles. Subsequently, the released DCFH probe is oxidized by ROS to a highly fluorescent dichlorofluorescein (DCF). Afterwards this product can be detected by CE-LIF. In our study we proceeded as follows: isolated chloroplasts were incubated with DCFH-DA under two different light and temperature conditions. The ROS level change in chloroplasts corresponding with the used conditions found expression in the amount of DCF in each sample, which was then detected. The results were standardized to the amount of chlorophyll a in each sample and statistically assessed by t-test, which proved the results to be significant (p < 0,01). This method may become a valuable tool in effort to understand all processes and principles including ROS.

Keywords

reaktivní formy kyslíku, kapilární elektroforéza, micelární elektrokinetická chromatografie, laserem indukovaná fluorescence, dichlorofluorescin diacetát, chloroplastreactive oxygen species, capillary electrophoresis, micellar electrokinetic chromatography, laser induced fluorescence, dichlorofluorescin diacetate, chloroplast

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 5. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 19. 6. 2012

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry