Sekvenčně specifická a strukturně selektivní vazba proteinu p53 a isoforem proteinu p73

Bc. Tomáš Komárek

Master's thesis

Sequence specific and structure selective binding of p53 and p73 isoforms

Abstract:

Nádorový supresorový protein p53 je transkripční faktor, který hraje klíčovou roli v buněčné odpovědi na různé formy stresových signálů a ochraňuje buňku před maligní transformací tím, že reguluje expresi mnoha genů buněčné ochrany, což může vést k zastavení buněčného cyklu, apoptóze anebo opravě DNA. Ale fungovat jako "ochránce genomu" se neobejde bez problémů, protože "Quis custodiet ipsos custodes? - Kdo stráží strážce" (Juvenal). A opravdu ve více než 50% nádorů byly objeveny mutace v některé z p53 drah. Předpokládalo se, že protein p53 je jediným členem rodiny proteinu p53, dokud nebyly v roce 1997 objeveny proteiny p73 a p63. Tyto proteiny se také podílí na potlačování nádorových onemocněních, ale působí jinými mechanismy než p53. Kromě suprese nádorů hrají tyto proteiny důležitou roli ve vývoji a diferenciaci. Všechny proteiny rodiny p53 mají obdobnou strukturu, s vysokou homologií v DNA-vazebné oblasti, naopak největší rozdíly jsou mezi C-koncovými doménami, protože proteiny p63 a p73 obsahují, na rozdíl od p53, SAM motiv. Základem funkce proteinu p53 je jeho schopnost vázat se na DNA. Centrální DNA vazebná doména je zodpovědná za sekvenčně specifickou vazbu na p53CON, ale protein p53 má unikátní vlastnost, že má ještě druhé DNA vazebné místo na C konci proteinu. Toto vazebné místo je zodpovědné za sekvenčně nespecifickou vazbu. V experimentální části práce jsme sledovali vazebné vlastnosti p53 a čtyř izoforem proteinu p73 na strukturně rozdílné molekuly DNA. S využitím postupné imunoprecipitace na magnetických kuličkách jsme testovali schopnost vazby těchto proteinů k topologicky pozměněné DNA. K regulaci superhelicity DNA bylo použito interkalační činidlo chloro-quin. Zjistili jsme, že p73 izoformy se vážou selektivně k negativně nadšroubovicové DNA, ale vazba k pozitivně nadšroubovicové DNA nebyla přímo pozorována. Dále jsme prokázali, že stabilita DNA komplexů s proteiny rodiny p53 je ovlivněna koncentrací solí v prostředí a různé typy vazby proteinů na DNA jsou odlišně citlivé k přítomnosti solí.

Abstract:

Tumor suppressor p53 is transcription factor, which plays key role in cell response to different forms of stress signals and protects cells against malignant transformation by regulating expression of many genes of cell defense which can leads to cell cycle arrest, apoptosis or DNA repair. But acting as "guardian of genome" is not without problems, because "Quis custodiet ipsos custodes? - Who watches the watchmen" (Juvenal). And obviously most of the human cancer contains mutations in the p53 pathways. It was thought that p53 is the only member of the p53 family until new members, p73 and p63, were discovered in 1997. These proteins are also involved in tumor suppression, although acting in a distinct way than p53. In addition to their tumor suppression role, these members play roles in the development and differentiation. All proteins of p53 family are quite similar in structure; the most conserved homology is the in central DNA binding domain, but the main difference is in C-terminal domain where proteins p63 and p73 have sterile alpha motive, which is absent in p53. Crucial for function of p53 as tumor suppressor is its ability to bind DNA. Core DNA-bind-ing domain is responsible for sequence specific DNA interaction. But protein p53 has also second DNA binding domain at C-terminus of protein, which is responsible for sequence non-specific DNA binding. In experimental part of this work we tested binding of p53 and four p73 isoforms to DNA molecules with different structures. Using "step-by-step" immunoprecipitation at magnetic beads we tested protein binding ability to topologically constrained DNA, where intercala-tive drug chloroquine was used for modulation of DNA superhelicity level. We found that p73 isoforms bind selectively to negatively supercoiled DNA but binding to positively su-percoiled DNA was not directly observed. We also demonstrated that stability of DNA complexes of p53-family proteins is affected by changes of salt conditions in the environment and that various modes of DNA binding are differently sensitive to the salt treatment.

Keywords

p73, p53, DNA damage, DNA-protein binding, chloroquine, ionic strength, supercoiled DNA binding

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 6. 6. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Mojmír Šob, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Physical Chemistry