Využití mikrofluidiky v proteinovém a metabolickém inženýrství

Mgr. Michal Vašina, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of microfluidics in protein and metabolic engineering

Abstract:

Enzymy a enzymové kaskády jsou schopné provádět celou řadu biotransformací, které nejen že udržují homeostázi živých organismů, ale rovněž poskytují produkty s přidanou hodnotou pro širokou škálu průmyslových odvětví. Jak enzymy, tak enzymové kaskády však obvykle neodpovídají průmyslovým požadavkům a jejich funkční vlastnosti je potřeba zlepšit. Za tímto účelem optimalizuje proteinové inženýrství enzymy a metabolické inženýrství enzymové kaskády pomocí tzv. Design-Build-Test-Learn cyklu, přičemž rychlost určujícím krokem obvykle zůstává fáze testování. Pro urychlení testovací fáze následují vědci trend miniaturizace a používají mikrofluidiku, která snižuje požadavky na experimentální čas a na množství vzorku oproti konvenčním experimentálním technikám. Díky mikrofluidice je možné nejen rychle sbírat komplexní kombinatorické data sety, ale paralelně také optimalizovat více parametrů daného biokatalytického systému. Tento typ experimentů však již není možné snadno řídit a vyhodnocovat pomocí běžných technik a vzniká zde potřeba pro vývoj algoritmů pro řízení experimentů a vyhodnocení komplexních dat s využitím strojového učení. Tato práce nejprve shrnuje současný stav využití mikrofluidních systémů pro proteinové i metabolické inženýrství. Následně popisuje vývoj a aplikaci tří mikrofluidních technik: (i) Microfluidic Profile Explorer (MicroPEX) pro charakterizaci enzymů z hlediska aktivity, teplotních profilů a substrátové specifičnosti, (ii) Kinetic Microfluidic Autonomous Platform (KinMAP) pro charakterizaci enzymů z hlediska kinetiky v ustáleném stavu a reakční termodynamiky a (iii) Cascade Microfluidic Autonomous Platform (CascadeMAP) pro multiparametrovou optimalizaci enzymových kaskád za využití strojového učení. MicroPEX a KinMAP byly použity k charakterizaci desítek variant enzymů z rodiny halogenalkandehalogenas, které jsou slibnými biokatalyzátory pro degradaci halogenovaných polutantů životního prostředí. Užitečnost platformy CascadeMAP je ukázána na optimalizaci dvou modelových enzymových kaskád, (i) syntetické metabolické dráhy pro degradaci toxického 1,2,3-trichlorpropanu vedoucí k neškodnému glycerolu a (ii) detekční kaskádu pro účinnou detekci glycerolu. Všechny tyto techniky významně urychlily charakterizaci a optimalizaci jak enzymů, tak enzymových kaskád a budou dále využity k vývoji vynikajících biokatalytických systémů.

Abstract:

Enzymes and enzyme cascades perform a plethora of biotransformations, not only maintaining the homeostasis of living organisms but also yielding value-added products for a wide range of industries. However, enzymes and enzyme cascades usually do not meet industrial requirements, and their functional properties must be improved. Therefore, protein and metabolic engineering utilize the design-build-test-learn cycle to optimize enzymes and enzyme cascades, respectively, yet the rate-limiting step usually remains in the testing phase. In order to accelerate the testing phase, scientists have been following the miniaturization trend and have utilized microfluidics to decrease both the time and sample requirements of conventional experimental techniques. Thanks to microfluidics, it is possible to quickly collect complex combinatorial datasets and optimize multiple parameters of a given biocatalytic system in parallel. However, this type of experiments can no longer be easily controlled and evaluated using conventional techniques, and there is a need for the development of algorithms for controlling experiments and evaluating complex data using machine learning. This Thesis first summarizes the state-of-the-art of utilization of microfluidic systems for both protein and metabolic engineering. Then, it describes the development and application of three microfluidic techniques: (i) Microfluidic Profile Explorer (MicroPEX) for characterization of enzymes in terms of activity, temperature profiles and substrate specificity, (ii) Kinetic Microfluidic Autonomous Platform (KinMAP) for characterization of enzymes in terms of steady-state kinetics and reaction thermodynamics and (iii) Cascade Microfluidic Autonomous Platform (CascadeMAP) for multiparameter optimization of enzyme cascades using machine learning. MicroPEX and KinMAP have been applied to characterize tens of enzyme variants from the model enzyme group of haloalkane dehalogenases, which are promising biocatalysts for degrading halogenated environmental pollutants. The performance of CascadeMAP is demonstrated on optimization of two model enzyme cascades: (i) a synthetic metabolic pathway for degradation of toxic 1,2,3-trichloropropane to reach harmless glycerol and (ii) a glycerol detection pathway for efficient glycerol detection. These techniques have significantly accelerated the characterization and optimization of both enzymes and enzyme cascades, respectively, and will be further utilized to develop superior biocatalytic systems.

Keywords

mikrofluidika, enzym, proteinové inženýrství, metabolické inženýrství, multiparametrová optimalizace, microfluidics, enzyme, protein engineering, metabolic engineering, multiparameter optimization

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 10. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 13. 12. 2023
• Supervisor: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.
• Reader: Ing. František Foret, CSc., prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Environmental Health Sciences / Environmental chemistry and toxicology