Exprese a aktivita enzymů podílejících se na regulaci redoxního stavu embryonálních buněk během jejich diferenciace

Bc. Lucia Binó, Ph.D.

Diplomová práce

Expression and activity of enzymes involved in regulation of embryonal cell redox status during cell differentiation

Abstract:

Fluctuations of cell redox state significantly influence physiology of the cells, including modulation of their differentiation. Reactive oxygen species (ROS), which are now well accepted as important mediators of cell functions regulation and intracellular signal transport, play a key role. Expression, activity and regulation of enzymes responsible for ROS production during embryonic stem cells differentiation is not clear. Therefore in this diploma thesis the issue of NADPH oxidases, enzymes responsible for ROS production, was studied. Flowcytometric measurements using various fluorescence dyes unveiled basal ROS production in various mouse embryonic stem cell models. One of the tasks was to optimize RT qPCR using Universal Probe Library technology and to introduce it into routine usage. Using this method we have observed expression of NADPH oxidases NOX1, NOX2 (including subunits p47phox and p67phox), NOX4, DUOX1 and DUOX2 in mouse embryonic stem cells. Regulation of NADPH oxidases by redox state modulating factors (H2O2, menadiol) was monitored using RT qPCR. However, our results did not reveal any influence of these compounds on NADPH oxidases expression. Expression and regulation of NADPH oxidases was also monitored in p38 knock-out mouse embryonic stem cells model, which exhibit increased adhesion. In this model, flowcytometric measurements showed increased level of reactive oxygen species and screening by RT qPCR showed increased NOX2 expression compared to wild type cells p38 +/+. NOX2 can be hence suggested as the one responsible for increased ROS production in p38 -/- cells. Generally it can be assumed that embryonic stem cells express NADPH oxidases, thus it can be hypothesized that NADPH oxidases contribute to detectable intracellular ROS production. NADPH oxidases can be classed with enzymes, which have potential to regulate embryonic stem cell differentiation and also their overall phenotype.

Abstract:

Zmeny redoxného stavu buniek výrazne ovplyvňujú fyziológiu buniek, vrátane modulácie ich diferenciácie. Kľúčovú úlohu hrajú intracelulárne produkované reaktívne matabolity kyslíku (reactive oxygen species - ROS), ktoré sú v súčasnosti považované za dôležité mediátory v regulácii bunkových funkcií a prenose intracelulárneho signálu. Expresia, aktivita a regulácia enzýmov zodpovedných za produkciu ROS počas diferenciácie embryonálnych kmeňových buniek je však nejasná. Preto bola v rámci tejto práce študovaná problematika NADPH oxidáz - enzýmov zodpovedných za produkciu ROS. Meraním na prietokovom cytometri bola u rôznych modelov myších embryonálnych kmeňových buniek detegovaná bazálna hladina ROS rôznymi fluorescenčnými značkami. Súčasťou práce bola optimalizácia metódy RT qPCR s využitím technológie Universal Probe Library a jej zavedenie do rutinného používania. Pomocou tejto technológie bola u myších embryonálnych kmeňových buniek pozorovaná expresia NADPH oxidáz NOX1, NOX2 (vrátane podjednotiek p47phox a p67phox), NOX4, DUOX1 a DUOX2. Pomocou RT qPCR bola sledovaná regulácia expresie NADPH oxidáz v závislosti na pôsobení faktorov modulujúcich redoxný stav bunky (H2O2, menadiol), výsledky však vplyv týchto činidiel na expresiu sledovaných NADPH oxidáz nepotvrdili. Expresia a regulácia NADPH oxidáz bola tiež sledovaná u modelu myších embryonálnych kmeňových buniek p38 -/- vykazujúcom zvýšenú adhéziu. Meraním na prietokovom cytometri bola u tohto modelu stanovená vyššia produkcia reaktívnych metabolitov kyslíku a pomocou RT qPCR vyššia expresia NOX2 v porovnaní s kontrolou p38 +/+. Výsledky teda naznačujú, že práve NOX2 je zodpovedná za zvýšenú produkciu ROS u buniek p38 -/-. Celkovo môžeme zhrnúť, že embryonálne kmeňové bunky exprimujú NADPH oxidázy, je teda možné predpokladať, že NADPH oxidázy prispievajú k detekovateľnej intracelulárnej tvorbe ROS. NADPH oxidázy je teda možné zaradiť k enzýmom, ktoré majú potenciál regulovať diferenciáciu embryonálnych kmeňových buniek a ich celkový fenotyp.

Klíčová slova

reaktívne metabolity kyslíku, reactive oxygen species, ROS, NADPH oxidázy, NADPH oxidases, redoxná signalizácia, redox signaling, embryonálna diferenciácia, embryonal differentiation

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 6. 2010
• Vedoucí: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika