Kvantitativní stanovení SMN1 a SMN2 genů u pacientů a heterozygotních přenašečů spinální muskulární atrofie

Mgr. Eva Zapletalová, Ph.D.

Doctoral thesis

Quantitative Determination of SMN1 and SMN2 Genes at Patients and Heterozygous Carriers of Spinal Muscular Atrophy

Abstract:

Spinální muskulární atrofie (SMA) je letální nervosvalové degenerativní onemocnění s autozomálně recesivním typem dědičnosti a incidencí kolem 1:5600. Onemocnění je způsobeno v 95% případů homozygotní delecí genu SMN1 (Survival of motor neuron) a v přibližně 5 % případů kombinací delece genu SMN1 a bodové mutace v tomto genu. Gen SMN2, který se od genu SMN1 liší pouze v 5 jednonukleotidových záměnách působí jako faktor modifikující fenotyp. Cílem mojí práce bylo zavedení kvantitativních metod pro určení počtu kopií genů SMN1 a SMN2, analýza bodových mutací v genu SMN1, analýza změn exprese genu SMN2 u pacientů léčených pomocí valproátu sodného (VPA) a fenylbutyrátu (PBA), analýza změn exprese genu SMN a změn acetylace histonů v promotorové oblasti genu SMN2 u tkáňových kultur po působení VPA a benzamidu M344. Pro určení počtu kopií genu SMN1 byly použity metody kompetitivní multiplex PCR a nebo PCR v reálném čase. Bylo vyšetřeno celkem 274 rodinných příslušníků pacientů s SMA. Jedna kopie byla nalezena u 142, dvě kopie byly nalezeny u 132 z nich. Dále bylo vyšetřeno 232 pacientů s podezřením na diagnózu SMA u kterých nebyla nalezena homozygotní delece genu SMN1. Jedna kopie genu SMN1 byla nalezena u 17 z nich. U 8 z těchto pacientů byly nalezeny bodové mutace. U 3 byla nelezena nejčastější mutace p.Y272C, u 1 mutace p.T274I a u čtyř doposud nepublikoavné mutace p.A188S, p.I33IfsX6., p.T37NfsX8 a p.T274YfsX32. Počet kopií genu SMN2 byl určen pomocí metody PCR v reálném čase u 122 pacientů s potvrzenou diagnózou SMA. U 25% byly nalezeny dvě kopie genu SMN2, u 55% byly nalezeny tři kopie genu SMN2, u 19% 4 kopie genu SMN2 a u 1% 5 kopií genu SMN2. Tyto výsledky se shodují s četnostmi uváděnými v literatuře. Ze 17 pacientů s SMA léčených pomocí PBA nebo VPA bylo zvýšení exprese genu SMN2 zaznamenáno přibližně u jedné čtvrtiny. Ke zlepšení funkčních motorických schopností došlo přibližně u jedné poloviny pacientů. U fibroblastových tkáňových kultur odvozených od pacientů s SMA bylo po působení VPA a M344 zaznamenáno zvýšení acetylace histonů v promotorové oblasti genu SMN průměrně šestinásobně v oblasti okolo 1 kB proti směru transkripce a přibližně dvojnásobně v oblasti okolo 100 pb proti směru transkripce. Signifikantní zvýšení exprese genu SMN2 nebylo zaznamenáno.

Abstract:

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a lethal neuromuscular degenerative disorder with authosomal recessive type of inheritance and incidence approximately 1:5600. This dissease is in 95% caused by homozygous deletion of the SMN1 (Survival of motor neuron) gene and approximately in 5% by deletion of SMN1 gene in combination with a point mutation in this gene on the second alelle. The SMN2 gene differs from SMN1 only in 5 mononucelotide exchanges and acts as a factor modificating phenotype. The aim of my work was the implementation of quantitative methods of SMN1 and SMN2 copy number determination in our laboratory; analysis of point mutations in SMN1 gene; analysis of SMN2 gene expression changes at patients treated with valproate (VPA) and phenylbutyrate (PBA); analysis of SMN2 gene expression changes and histone acetylation changes in SMN2 promotor region of fibroblast cultures after treatment with VPA and benzamide M344. For SMN1 copy number determination, Competitive Multiplex PCR and Real-time PCR methods were used. SMN1 copy number was determined at 274 family members of patients with confirmed SMA. One copy of SMN1 gene was found at 142 of them and 2 copies at 132 of them. Further SMN1 copy number was determined at 232 of patients with suspicion to SMA diagnosis and without homozygous deletion of the SMN1 gene. One copy of SMN1 gene was found at 17 of them. At 8 of these patients point mutations were found. At three the most common mutation p.Y272C was found, at 1 it was mutation p.T274I and at four patients, mutations which have not been published yet were found: p.A188S, p.I33IfsX6, p.T37NfsX8 a p.T274YfsX32. SMN2 gene copy number was determined with Real-time PCR method in 122 samples from patients with confirmed SMA diagnosis. Two copies were found in 25% patients, three copies in 55%, four copies in 19% and five copies in 1% of patients. These numbers correspond with previously published results. 17 patients with confirmed SMA were treated with PBA or VPA. The increase in SMN2 expression was detected in approximately 25% of patients, the increase of functional motor skills in 50% of patients. Fibroblast cultures derived from patients with SMA were treated with VPA and M344. Acetylation of histones in the promotor region of the SMN gene increased aprroximately 6 times in the region of around 1000 bp and approximately 2 times in the region of around 100 bp upstream from transcriptional start site. There was no change in expression of the SMN2 gene detected.

Keywords

spinální muskulární atrofie, gen SMN, kvantitativní PCR, inhibitory histonových deacetyláz, Spinal Muscular Atrophy, SMN gene, quantitative PCR, histone deacetylase inhibitors

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 8. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 23. 10. 2009
• Supervisor: doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.
• Reader: prof. MUDr. Lydie Izakovičová Hollá, Ph.D., doc. MUDr. Josef Zámečník, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology