Vliv cytokininů a světla na obsah malondialdehydu u senescentních listů Arabidopsis thaliana

Bc. Maroš PRČINA

Master's thesis

Effect of cytokinins and light on malondialdehyde content in senescent Arabidopsis thaliana leaves

Abstract:

Tak jako vliv cytokininů patří mezi nejvýznamněší endogenní faktory regulující nástup a průběh senescence, tak i vliv světla patří mezi nejvýznamnější exogenní faktory. Z dosavadních výsledků studia vlivu cytokininů a světla na senescenci plyne, že oba faktory působí aditivně, přičemž existuje hypotéza o existenci hranice signálního výstupu obou faktorů a překlenutí této hranice vyvolávající změnu charakteru jejich vlivu na senescenci z regulace negativní na pozitivní. Ve své diplomové práci jsem pro ověření výše zmíněných faktů kultivoval listy rostlin Arabidopsis thaliana, u nichž byla jejich oddělením uměle navozená senescence, a analyzoval jsem u těchto listů míru oxidativního poškození. Listy byly kultivovány v roztocích s různými koncentracemi cytokininu (meta-topolinu, mT nebo benzyladeninu, BA) a současně při různých intenzitách světla (tma, pěstební intenzita a vysoká intenzita světla). V experimentech byly použity rostliny různých genotypů včetně mutantů pga22, u nichž lze 17--estradiolem indukovat zvýšení biosyntézy cytokininů. Vedle těchto mutantů byli testováni dvojití ahk- mutanti s vyřazenou funkcí dvou ze tří (dosud známých) receptorů zodpovědných za vnímání cytokininů, jež patří mezi Arabidopsis histidinkinasy (AHK). To umožnilo prozkoumání úlohy jednotlivých AHK receptorů. Pro analýzu oxidativního poškození byly použity dvě metody: První metodou byla běžně používaná analýza TBARS - produktů reakce s kyselinou thiobarbiturovou. Druhou metodou bylo nově testované stanovení obsahu malondialdehydu (MDA) pomocí HPLC s využitím DNPH reagentu. Pro možnost podrobnější analýzy a rozšíření kontextu byly také analyzovány výsledky Mgr. Melkovičové: obsah chlorofylu a maximálního kvantového výtěžku fotochemie fotosystému II (Fv/Fm); experimenty byly vedeny souběžně a za stejných podmínek. Výsledky ověřily a potvrdily výše zmíněná dosavadní zjištění jiných autorů a hypotézu o zvratu pozitivního vlivu cytokininů a světla na senescenci při překročení hranice jejich nadměrného aditivního vlivu. Ohledně rolí jednotlivých známých AHK receptorů jsem zjistil, že během senescence oddělených listů Arabidopsis má na regulaci oxidativního poškození ze tří známých receptorů nejvýznamnější vliv AHK4 (CRE1 / WOL1), menší vliv má pak AHK2 a nejméně významný vliv má AHK3 receptor. Pořadí v síle ovlivnění udržení obsahu chlorofylu je u těchto tří receptorů překvapivě právě opačné. Nečekaným výsledkem této práce je zjištění, že 17--estradiol, tedy lidský hormon použitý pro cílenou indkuci rostlin pga22, má fyziologické účinky (v rámci sledovaných parametrů) na listy rostlin, jež na rozdíl od pga22 nebyly geneticky modifikovány pro účel indukce estradiolem.

Abstract:

As the effect of phytohormones cytokinins is one of the most important endogenous factors regulating onset and ongoing of senescence, so is the effect of light amongst the most important exogenous factors. Current research in senescence shows, that the effect of cytokinins and light on senescence has additive character. There is also a hypothesis that the output signal of the two factors may have certain treshold, which turns the effect of cytokinins and light from protective against senescence into speeding up the senescence. To prove the above mentioned facts and hypothesis, I detached Arabidopsis thaliana leaves, hence induced an artificial senescence, which was consequently studied. The leaves were cultivated and analysed for the level of damage, caused by oxidative stress. The cultivation was conducted under diverse conditions which combined application of differently concentrated cytokinins (meta-topolin, mT or benzyladenin, BA) in cultivating solution, and three distinct light conditions (dark, growth light intensity and high light intensity). I used several plant genotypes, including pga22 mutants with 17--estradiol-inducible overexpression of IPT, thus overproducing endogenous cytokinins. To assess specific roles of three so far known cytokinine receptors (belonging to Arabidopsis Histidin Kinase family), I used three distinct ahk- double-mutants with nonsense mutations in two genes encoding AHK receptors. I analysed an oxidative damage in the senescent leaves of the mutants. Firstly I used the common TBARS analysis of products reacting with thiobarbituric acid. Secondly, I tested new method - HPLC analysis of malondialdehyde (MDA) content, using DNPH as a reagent. For more complex conclusions, I also assessed results of the colleague of mine, Helena Melkovičová,. She analysed relative chlorophyll content and maximum quantum yield of photochemistry of photosystem II (Fv/Fm), whereas our experiments had been conducted under the same experimental conditions and plants. The results confirmed formerly proposed hypothesis: cytokinins and light act in an dditive manner, and that if their signal output crosses the treshold, their senescence-protective effect turns into senescence accelerating. The most interestig result emerges from comparing the results of all three ahk- double-mutants: The conclusion, that the highest impact in regulating the oxidative stress has the AHK4 (CRE1 / WOL1) receptor, the lowest has the AHK3, whereas AHK2 is inbetween the other two receptors. In contrary, a degree of the regulatory effect on the chlorophyll content is just opposite, with AHK3 having the strongest and AHK4 the weakest effect. Beside this, I found out the surprising conclusion, that the human hormone 17--estradiol acts not only as an inductor for (in this way) genetically modified pga22, but that the hormone has a noticeable effect on plant physiology as well.

Keywords

senescence, cytokinin, světlo, oxidativní poškození, malondialdehyd (MDA), Arabidopsis, AHK2, AHK3, AHK4 / WOL1 / CRE1, ahk- dvojití mutanti, pga22

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 7. 2015

Accessible from:: 24. 7. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Alexandra Husičková, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology