Klonování, exprese a purifikace hypotetické cytokinindehydrogenasy z cyanobakterie Nostoc 7120

Nela GALASOVSKÁ

Bakalářská práce

Cloning, expression and purification of hypothetical cytokinin dehydrogenase from the cyanobacterium Nostoc 7120.

Anotace:

Cílem této bakalářské práce byla příprava rekombinantního enzymu cytokinindehydrogenasy z cyanobakterie Nostoc PCC 7120, který byl zmutován v důležité HFG doméně na C-konci. Cyanobakterie Nostoc patří do řádu Nostocales a je využívána v zemědělství při pěstování rýže. V genomu této cyanobakterie, byl nalezen gen pro enzym cytokinindehydrogenasu (CKX), která ireversibilně štěpí rostlinné hormony cytokininy. V experimentální části byla provedena optimalizace podmínek pro PCR a následná amplifikace genu NoCKX, klonování tohoto genu do vektoru pTYB12 a následná transformace do E.coli. Vzniklý rekombinantní plasmid pTYB12::NoCKX byl použit pro expresi proteinu v E.coli. Výsledný enzym byl purifikován pomocí afinitní chromatografie. Chromatografické frakce byly podrobeny SDS PAGE elektroforéze, pomocí niž byla potvrzená přítomnost studovaného proteinu. Aktivita byla měřena spektrofotometricky avšak neúspěšně. Exprese proteinu byla potvrzena i díky imunoblottingu a také analýze s využitím MALDI TOF.

Abstract:

The objective of this work was the preparation of the recombinant enzyme cytokinin dehydrogenase from cyanobacterium Nostoc PCC 7120, that was mutated in a significant HFG domain on a its C-terminus. Cyanobacterium Nostoc belongs to the order Nostocales and is used in agriculture in rice cultivation. In its genome the gene for the cytokinin dehydrogenase (CKX) was found. This enzyme irreversibly cleaves plant hormones cytokinins. In the experimental part optimizitaion of PCR conditions and subsequent amplification of the gene NoCKX was carried. The gen was cloned into pTYB12 vectorand the construct was transformedinto E. coli. Recombinant plasmid pTYB12::NoCKX was used for protein expression in E. coli and the resulting enzyme was purified by affinity chromatography. Chromatographic fractions were subjected to SDS- PAGE electrophoresis, which confirmed the presence of the studied protein. Activity was measured spectrophotometrically but without a positive result. Protein expression was confirmed thanks to immunoblotting and also analysis by MALDI - TOF.

Klíčová slova

cytokininy, cytokinindehydrogenasa, Nostoc PCC 7120, transformace, exprese, purifikace

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 8. 2014

Zveřejnit od: 22. 8. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Mgr. Marta Greplová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie